章余妹，吴 萍，张林杰，吕 磊，杨守梅

RIP1增强顺铂诱导食管癌细胞的凋亡

章余妹1，吴 萍1，张林杰1，吕 磊2，杨守梅2

目的 探讨受体相互作用蛋白1（RIP1）增强顺铂（DDP）诱导食管癌细胞凋亡的敏感性。方法 单溶液细胞增殖分析（MTS）法检测不同浓度DDP对食管癌细胞株KYSE510、KYSE410的增殖抑制作用；Annexin V／PI双染流式细胞术检测细胞凋亡；Western blot法检测RIP1、半胱天冬氨酸蛋白酶3（caspase－3）、PARP的蛋白表达。结果 DDP诱导食管癌细胞凋亡具有剂量和时间相关性。凋亡率随剂量增加和时间延长升高，RIP1蛋白的表达升高，DDP联合RIP1特异性抑制剂处理食管癌细胞后，较敏感的KYSE510凋亡率明显减少。结论 RIP1可能参与了DDP诱导食管癌细胞凋亡的作用。

食管癌；RIP1；顺铂；凋亡

食管癌是国内外常见的消化道恶性肿瘤之一，据统计，全球每年新发食管癌48万例，每年约有40万人因此死亡，我国是食管癌高发国家［1］。辅助化疗是治疗食管癌的一种重要手段，但其预后的改善进展却很缓慢［2］。因此，研究增强食管癌对药物治疗敏感性的策略，发现新的治疗靶点至关重要。受体相互作用蛋白1（receptor-interacting protein 1，RIP1）包含一个N末端丝氨酸／苏氨酸激酶活性和一个C末端死亡结构域，是RIP家族中第一个被发现的成员，在调节细胞的死亡和存活方面起重要作用［3－4］。然而，目前RIP1在食管癌细胞增殖、凋亡及药物治疗敏感性方面起何种作用尚不明确。该研究以食管癌细胞株KYSE510、KYSE410为研究对象，观察RIP1对顺铂（cisplatin，DDP）诱导的食管癌细胞凋亡的影响，并对其机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株 人食管鳞癌细胞株KYSE510、KYSE410由安徽省肿瘤医院肿瘤研究所惠赠。

1.1.2 主要试剂和仪器 RPMI1640培养基（美国Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；胰蛋白酶（美国Gibco公司）；DDP（5 mg／ml，江苏豪森药业股份有限公司）；MTS（美国Promega公司）；小鼠抗人RIP1抗体（美国BD Pharmingen公司）；兔抗人半胱天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartate specific protease 3，caspase-3）、PARP抗体（美国Santa Cruz公司）；小鼠抗人β-actin抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；小分子抑制剂（necrostatin-1，Nec-1）（德国Calbiochem公司）；Annexin V／PI细胞凋亡检测试剂盒（上海贝博BestBio公司）；BCA蛋白定量试剂盒、Western一抗稀释液（江苏碧云天公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；天能全自动数码凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 食管癌细胞株KYSE510、KYSE410采用RPMI1640培养液，含10%灭活胎牛血清，37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。常规传代，生长至对数生长期。

1.2.2MTS法检测 取96孔细胞培养板，每孔中加100 μl含10 000个细胞的RPMI 1640培养液，在37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养使细胞贴壁。培养24 h后，弃去每孔培养液，换新鲜含10%胎牛血清培养液，实验设不同浓度DDP处理组（药物浓度为1、5、10、20、40 μg／ml）、不加DDP的空白对照组和无细胞仅培养液的凋零组。加药后分别在24～72 h（药物作用终点时间）终止培养，每孔加入MTS 10 μl，37℃避光孵育2 h，全自动定量绘图酶标仪测定每孔的490 nm波长光密度（optical density，OD）值，各组重复实验3次。

1.2.3 Annexin V／PI双染检测细胞凋亡 将对数生长期的细胞制成单细胞悬液接种于24孔板，每孔中每1 ml含1×105个细胞，培养24 h后，PBS洗涤2次，按实验设计加入药物后，收集上清液中细胞并用不含EDTA的胰酶消化法收集贴壁细胞至10 ml离心管。用冷PBS洗涤细胞2次，1 400 r／min，2～8℃，离心5 min，弃培养液，用400 μl 1×Annexin V结合液悬浮细胞，浓度约为1×106个／ml细胞。在细胞悬浮液中加入5 μl Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀后于2～8℃避光条件下孵育15 min，加入10 μl PI染色液后轻轻混匀于2～8℃避光条件下孵育5 min。1 h内上流式细胞仪检测，每组实验重复3次。FCS express 4软件分析细胞凋亡率。

1.2.4 Western blot法检测蛋白表达 5 μg／ml DDP作用于细胞不同时间点（0、6、12、24、36 h）后，分别收集上清液中细胞并加胰酶消化收集贴壁的细胞至离心管。用PBS洗涤2次，1 500 r／min，离心10 min，弃上清液，每管加入100 μl细胞总蛋白裂解液（90 μl裂解储存液＋10 μl苯甲基磺酰氟化物），吸至1.5 ml EP管中，冰上孵育30 min，期间不时弹EP管。以4℃14 000 r／min，离心30 min后取上清液，此即为细胞总蛋白。BCA法蛋白定量后，加入等体积的2×SDS凝胶上样缓冲液，煮沸3 min使蛋白变性。取20 μg蛋白样品在不同浓度的SDSPAGE凝胶中恒压电泳约60 min，再转移至硝酸纤维素膜上，转膜约70 min，防止气泡产生，用含质量为50 g／L脱脂奶粉的TBST封闭2 h，弃去封闭液。TBST洗涤3次，每次10 min，分别加入抗RIP1、caspase-3、PARP抗体，以β-actin为内参，4℃孵育过夜，用TBST洗3次，每次10 min，再加辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG或山羊抗兔IgG抗体，室温孵育1 h，TBST洗涤3次，每次10 min。ECL法显色，照相并分析结果。每组实验重复3次。

1.3 统计学处理采用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示。多组均数间比较采用方差分析，两组间均数比较采用t检验。

2 结果

2.1 DDP对食管癌KYSE510、KYSE410细胞的增殖抑制作用KYSE510、KYSE410细胞对DDP的半数抑制浓度分别为（5.021±0.069）μg／ml、（40.169±0.302）μg／ml，差异有统计学意义（P＜0.01）；后者是前者的8倍，因此选5 μg／ml作为KYSE510和KYSE410的实验浓度。5 μg／ml DDP作用于两株细胞0、24、48、72 h，随着时间的延长，KYSE510细胞存活率减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。结果显示，DDP诱导食管癌KYSE510、KYSE410细胞凋亡具有浓度和时间相关性，且KYSE510对DDP诱导凋亡相对敏感。见图1。

2.2 DDP诱导食管癌KYSE510、KYSE410细胞的凋亡流式细胞仪结果显示DDP能有效诱导食管癌细胞凋亡，随着作用时间延长，细胞凋亡率逐渐上升。KYSE510细胞的早期凋亡率差异有统计学意义（F＝5 849.181，P＜0.01），KYSE410细胞的早期凋亡率差异也有统计学意义（F＝6 512.189，P＜0.01）。两株细胞对DDP的敏感性不同，KYSE510比KYSE410细胞对DDP敏感，同一时间点的两株细胞凋亡率之间进行比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），见图2。

2.3 RIP1在DDP处理食管癌细胞前后的蛋白表达Western blot法检测结果显示KYSE510细胞RIP1表达水平较KYSE410细胞高，差异有统计学意义（P＜0.01）；DDP处理前后KYSE510细胞RIP1表达水平较高，差异有统计学意义（P＜0.01），见图3、4。

2.4 caspase-3、PARP在DDP处理食管癌细胞不同时间点的蛋白表达Western blot法检测结果显示KYSE510细胞caspase-3、PARP活化并裂解。见图5。

2.5 Nec-1联合DDP处理细胞前后的凋亡流式细胞仪检测结果显示：对DDP较敏感的KYSE510细胞加入Nec-1后早期凋亡率减少明显，存活率增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。而相对不敏感的KYSE410细胞加入Nec-1后变化不明显，差异无统计学意义。见图6。

2.6 DDP联合Nec-1处理细胞前后，RIP1、caspase-3、PARP的蛋白表达Western blot法检测结果显示DDP联合Nec-1处理KYSE510、KYSE410细胞前后RIP1、caspase-3、PARP的蛋白表达。见图7。

3 讨论

DDP是常用的食管癌化疗药物之一，可通过产生烷化物作用于DNA，形成链内和链间交联，破坏肿瘤细胞DNA结构和功能，启动DNA损伤性反应和肿瘤细胞凋亡途径的激活，导致肿瘤细胞死亡［5］。研究［5－6］表明，以DDP为基础的化疗开始疗效较好，但随着化疗时间的延长、疗程的增加、肿瘤细胞对DDP治疗的敏感性降低或产生耐药性，临床疗效降低。表明DDP对食管癌细胞之间存在敏感性差异。

RIP1在细胞的凋亡、程序性坏死与存活等过程中发挥了重要作用［7］。在促细胞死亡的信号转导中，RIP1的C末端死亡结构域能与Fas、肿瘤坏死因子受体1、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体1、受体2、肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域等蛋白相互作用，形成复合物，导致凋亡或程序性坏死［8］。Nec-1是RIP1的高度特异性抑制剂，通过变构抑制RIP1的活性［9］，与RIP1的N端和C端结合产生变构效应，使RIP1保持在无活性的构象［10］。抑制RIP1和相关受体相互作用，也阻止了凋亡或程序性坏死的进行［11］。Nec-1的发现能有效地明确RIP1在不同细胞的死亡类型和在疾病中的作用［12］。本研究中，DDP在两株食管鳞癌细胞中敏感性差异大，而RIP1在两株细胞中的表达差异也较大；加入DDP后，较敏感细胞株KYSE510的RIP1上调明显，而相对DDP耐受的KYSE410细胞株RIP1上调不明显，表明RIP1可能增强DDP对食管鳞癌细胞的敏感性。caspase-3是凋亡的效应分子，其活化后可导致凋亡；PARP激活后裂解，为caspases级联反应保存能量，使caspases依赖性的凋亡能够顺利进行［13］。通过AnnexinV／PI双染流式细胞仪检测凋亡显示，DDP诱导食管鳞癌凋亡随着时间的延长凋亡率上升；加入Nec-1后，较敏感的KYSE510细胞凋亡率明显减少，存活率增加，而相对耐受的KYSE410细胞差异不明显。通过Western blot法检测RIP1、caspase-3和PARP的蛋白表达，可以看出KYSE510细胞的RIP1在加入DDP后表达增强，加入DDP和Nec-1后表达减低；而KYSE410细胞则在加入DDP或DDP联合Nec-1后无明显变化。

综上所述，RIP1参与DDP诱导食管癌细胞的凋亡，并且Nec-1处理后对DDP敏感的食管癌细胞株凋亡率明显减少，RIP1的蛋白表达减低，因此RIP1可能介导了DDP诱导食管癌细胞凋亡的作用。本研究对进一步探索抗肿瘤治疗及抗癌药的耐药性提供了一定的基础，但其深入的分子机制还有待研究。

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RIP1 enhances DDP sensitivity of human esophageal squamous carcinoma cells

Zhang Yumei，Wu Ping，Zhang Linjie，et al
（Dept of Immunology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the role of receptor-interacting protein 1（RIP1）on the sensitivity of human esophageal squamous carcinoma cells to cisplatin（DDP）-induced apoptosis and explore a new target for clinical treatment of esophageal squamous carcinoma.MethodsThe viability of human esophageal squamous carcinoma cell lines KYSE510 and KYSE410 exposed to different concentrations of DDP were detected by CellTiter 96®AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（MTS）assay.Annexin V／PI staining was used to observe cell apoptosis in KYSE510 and KYSE410 cells.Western blot was used to detect RIP1，caspase-3，PARP expression in KYSE510 and KYSE410 cells exposed to DDP.ResultsDDP induced apoptosis in esophageal squamous carcinoma cells with dose and time dependency.Apoptotic rate was increased with dose and time，RIP1 expression was upregulated in esophageal squamous carcinoma cell lines.It was significantly reduced after exposure to DDP association special inhibitor of RIP1 in KYSE510 cells which were more sensitive to DDP than KYSE410 cells.ConclusionRIP1 maybe participates in the apoptosis of human esophageal squamous carcinoma cells to DDP，suggesting the potential of RIP1 as a new candidate target for clinical treatment of esophageal squamous carcinoma.

esophageal squamous carcinoma；RIP1；cisplatin；apoptosis

R 735.1；R 329.25

1000－1492（2015）02－0172－05

2014－10－23接收

安徽省高等学校省级自然科学研究项目（编号：KJ2011A167）

1安徽医科大学免疫学教研室，合肥 2300322安徽省肿瘤医院肿瘤内科，合肥 230001

章余妹，女，硕士研究生；张林杰，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：zlj33＠vip.sina.com