田建平+李娟玲+胡远艳+刘国民

摘要：采用超声提取和RP-HPLC法分析了6种冬青属苦丁茶新干燥的功能叶及苦丁茶冬青植物在不同发育阶段、不同地域、野生与栽培材料、不同存放时间下功能叶中的绿原酸含量。结果表明，不同样品材料中的绿原酸含量由大到小排序依次为苦丁茶冬青、霍山冬青、大叶冬青、五棱苦丁茶、华中枸骨、枸骨;新干燥的成熟叶样品在室温下存放2个月后绿原酸的含量显著下降;在野生的苦丁茶冬青叶片不同发育阶段中，一般是以老叶样品中的绿原酸含量高;野生苦丁茶冬青植株叶片中绿原酸的含量要高于栽培植株叶片中绿原酸的含量。6种冬青属苦丁茶叶片样品中的绿原酸含量存在较大的种间差异。

关键词：冬青属苦丁茶;绿原酸;反相高效液相色谱;资源利用

中图分类号：TS275.2        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）12-2889-03

Comparison of Chlorogenic Acid in Leaves from Six Ilex Species Used as Kudingcha by RP-HPLC

TIAN Jian-ping1a，1b，2，LI Juan-ling1c，HU Yuan-yan1d，LIU Guo-min1a，1b

（1.a.Kudingcha Research Institute，b.College of Agriculture，c.Horticulture and Landscape College，d.Key Laboratory for Tropical Biological Resources，Hainan University，Haikou 570228，China;2.Department of Pharmacy，Hainan Medical College，Haikou 571101，China）

Abstract：Chlorogenic acid in the mature leaf was extracted ultrasonically and analyzed by RP-HPLC from six Ilex species and I.kudingcha in different developing stage，region and storaging time，wild and cultivated samples. The results showed that the content of chlorogenic acid in fresh mature leaves of six species was I. kudingcha> I. huoshanesis> I. latifolia > I. centrochinensis > I. pentagona > I. cornuta. The significant decrease of chlorogenic acid in dried fresh leaf was observed after two months. In general，its content in old leaf was highest among different developing stage，and the content of wild leaf was higher than cultivation one. There were large differences among six Ilex species in the contents of chlorogenic acid.

Key words： Kudingcha species in Ilex L.; chlorogenic acid; RP-HPLC; resource utilization

苦丁茶是我国民间广泛用于制备代茶饮品（或茶药两用）的一大类代茶植物的统称。其原植物来源广泛，涉及12科13属，至少有36种之多（含变种和变型）[1-3]。冬青属苦丁茶是我国两大类最重要的苦丁茶之一。该类苦丁茶主要包括苦丁茶冬青（Ilex kudingcha C.J.Tseng），大叶冬青（I. latifolia Thunb），枸骨（I. cornuta Lindl），霍山冬青（I. huoshanesis Y.H.He，五棱苦丁茶（I. pentagona S.K.chen Y.X.Feng et C.F.Liang），华中枸骨（I. centrochinensis S.Y.Hu）等6个物种。这些苦丁茶物种主要分布于我国广东、广西、海南、浙江、安徽和贵州等省区[4-6]。根据种植面积、经济价值以及在国内外的影响情况，苦丁茶冬青被众多专家认定为“大叶苦丁茶”正品。冬青属苦丁茶中化学成分种类繁多，其中的绿原酸作为一种多酚活性成分，已广泛应用于食品、医药和日用化工等领域。目前，有关冬青属植物的绿原酸含量分析报道较少[7-9]。本试验采用HPLC法比较了不同品种、不同产地、不同来源、不同发育时期和贮藏条件下苦丁茶叶片样品中的绿原酸含量，为冬青属苦丁茶植物种质资源的合理开发利用及产品质量控制提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料与试剂

冬青属苦丁茶叶片样品收集于全国各地，样品经海南大学黄世满教授鉴定，分别为冬青科植物苦丁茶冬青、大叶冬青、五棱苦丁茶、枸骨、霍山冬青和华中枸骨，其中苦丁茶冬青包含野生与栽培2类样品，其余5种均为栽培样品。凭证标本保存于海南大学苦丁茶研究所标本室，相关信息见表1。

绿原酸标准品（110753-200413，98%），购于中国食品药品检定研究院。endprint

提取用甲醇和磷酸为分析纯（广州化学试剂公司），色谱分析用甲醇和乙腈为色谱纯（Sigma，美国），去离子水。

1.2  主要仪器

2695-2487型高效液相色谱仪（Waters，美国）

1.3  方法

1.3.1  材料采集  分别采集不同产地苦丁茶冬青野生和栽培材料叶片各8批，每批野生材料分为3类（幼嫩叶、功能叶和老叶）;栽培材料只采集功能叶。新鲜叶片材料于50 ℃干燥后室温放置;2月后再分别采集6种冬青属植物栽培材料的新鲜功能叶，其中苦丁茶冬青来源于样品9。随即将上述不同时段采集的样品同时分析。

1.3.2  样品前处理  取样品于50 ℃烘干，粉碎后过24目筛备用。称取1.000 g左右样品，置具塞三角瓶中，加入50%（V/V，下同）甲醇20 mL，称定重量。超声提取（40 kHz，180 W）30 min，放冷，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，50%甲醇洗涤2～3次，取续滤液置于25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀。精密吸取600 μL于4 mL离心管，于0.22 μm微孔滤膜过滤后，待测。

1.3.3  标准品的配制  称取绿原酸标准品10.4 mg于10 mL棕色量瓶内，用甲醇（色谱纯）溶解并稀释至刻度，摇匀，得1.04 mg/mL标准品贮备液，10 ℃保存，待用。

1.3.4  色谱分析  在预试验基础上，参照文献[10]色谱条件：采用XBridge C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）为固定相，以乙腈-0.06%磷酸（V/V=1/9）为流动相;流速1.0 mL/min，检测波长327 nm，柱温30 ℃。

1.3.5  方法学分析  根据回归分析得到绿原酸浓度标准曲线，RP-HPLC方法系统适用性、精度及重复性试验参照文献[10]。

2  结果与分析

2.1  方法学分析

绿原酸标准品和样品色谱图分别见图1和图2。在上述色谱条件下，理论塔板数按绿原酸计算不低于1 000，样品中的绿原酸不受杂质干扰。

对不同浓度标准品进行测定，计算绿原酸的标准曲线为Y=4×107X-125 553（r=0.996 9），吸取适量标准品溶液，连续进样5次，测得峰面积RSD为0.36%（n=5），表明仪器精密度良好。稳定性试验中，各峰面积RSD=0.8%（n=5），表明样品溶液在8 h内稳定，重复性结果表明峰面积RSD=1.13%（n=5），即方法重复性较好。

2.2  功能叶中绿原酸含量的比较

绿原酸含量测定时各材料测量均重复5次，冬青属苦丁茶栽培样品新鲜功能叶中绿原酸含量见图3。由图3可知，苦丁茶冬青所含绿原酸的质量百分含量（以下简称含量）最高（0.58%），霍山冬青、大叶冬青、五棱苦丁茶及华中枸骨所含绿原酸含量次之，枸骨叶中的绿原酸含量最低。

2.3  不同发育阶段叶片中绿原酸含量的比较

经低温干燥处理，室温密封保存2月后，各产地的苦丁茶冬青野生样品在不同发育时期叶片（老叶、功能叶、幼叶）中的绿原酸含量见图4，除样品7和8外，都是老叶中的绿原酸含量大于功能叶，绿原酸含量最高者为样品2，含量达0.26%。

2.4  不同产地野生与栽培材料功能叶中绿原酸含量的比较

经干燥处理，室温放置2个月后，各产地的苦丁茶冬青野生与栽培材料功能叶中的绿原酸含量见图5。由图5可知，整体上野生材料中的绿原酸含量要高于栽培材料，但在栽培样品中，14号样品的绿原酸含量最高（0.12%），样品15含量最低（0.05%）;在野生样品中，5号样品含量最高（0.08%）。

另外，由图3与图5的比较可知，苦丁茶冬青新鲜功能叶所含绿原酸含量是低温处理放置2个月样品含量的9倍。

3  讨论

苦丁茶冬青是应用最广泛的冬青属苦丁茶。就绿原酸含量而言，以苦丁茶冬青的绿原酸含量最高，霍山冬青次之。比较已报道的冬青属苦丁茶中的齐墩果酸和熊果酸含量，霍山冬青也位列第二[11]，因此霍山冬青是一种值得开发的冬青属苦丁茶种质资源。另外，上述结果表明野生样品中绿原酸含量整体上要高于栽培样品。这种现象可能与其产地或遗传因素有关，为选育苦丁茶良种提供了参考。

绿原酸是多酚类化合物，分子中含有酯键、不饱和双键及多酚3个不稳定结构，因此其储藏条件将直接影响绿原酸在叶中的含量。通过比较新鲜叶片和室温密闭放置2个月后叶片中的绿原酸含量，发现后者所含的绿原酸含量急剧下降。因此传统苦丁茶工艺中的“杀青”措施，对于抑制鲜叶中多酚化合物的酶促氧化反应十分必要。另外老叶所含的绿原酸含量较高，可能与其感染了菌类，呼吸作用强烈从而促进绿原酸的合成相关。

综上所述，冬青属苦丁茶不同样品中的绿原酸含量差异较大，这可能与物种，基因型或者种质材料的所在地域相关;苦丁茶冬青作为冬青属苦丁茶的主流种类，是人工栽培面积最大和产量最高的冬青属苦丁茶种类，可考虑从其种质资源库中筛选出一些富含绿原酸且综合性状良好的种质资源材料，通过组培或扦插等无性繁殖手段加速繁殖，尽快培育出富含绿原酸且高产优质的新品系或新品种，并在生产上大面积推广种植，进而通过绿原酸延伸和扩展苦丁茶冬青的产业链，从而进一步提高苦丁茶产业的经济效益。

参考文献：

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