田智勇,柴 郑,徐亚菲,赵净净,凌春生

(河南大学药学院,河南开封475004)

正交设计优选枳椇子中总黄酮的提取工艺

田智勇,柴 郑,徐亚菲,赵净净,凌春生*

(河南大学药学院,河南开封475004)

目的研究枳椇子总黄酮的超声提取最佳工艺条件;方法利用超声提取法,以药材目数、料液比、超声温度、超声功率为考察因素,枳椇子中芦丁的含量为考察指标,紫外分光光度法测定(417 nm)结果最佳提取工艺:干燥药材(20～40目)中加入14倍量的体积分数70%乙醇溶液,超声功率:160 W、温度:70℃、时间:60 min时含量最高,为1.17 mg/g。回归方程为A=0.033 3C―0.022 3(r=0.999 3),芦丁在5.84～23.36μg/m L范围内线性关系良好,平均回收率为96.92%。结论超声法提取枳椇子中的芦丁优势明显,有效成分溶出快、用时短、效率高,紫外测定其含量灵明度较高、准确。

枳椇子;总黄酮;芦丁;超声提取

枳椇子药效广泛,能抗癌、抗肝脏毒、抗炎、抗菌、抗病毒、抗自由基[1-3],致泻、解痉,同时对心血管系统也有作用。现有文献[4-6]报道,枳椇子中的黄酮类化合物对急性酒精中毒有预防作用,能减轻有毒物质对肝细胞的损伤。2-苯基色原酮为黄酮类化合物的母核,与显色剂(10g/L AlCl3的乙醇溶液)[7]反应生成的络合物在紫外下有吸收,在一定浓度范围内下其浓度与吸光度符合朗伯―比尔定律。枳椇子总黄酮常见提取方法有:传统提取法(浸渍法、煎煮法、渗漉法、回流法);碱提酸沉法;溶剂萃取法等。这些方法提取时间长、溶剂用量大、提取率不高,而超声法[8]是利用超声辐射所产生剧烈的机械振动、微扰效应、等物理作用产生的强大瞬间压差能够快速破坏植物的细胞壁。加速胞内成分的释放,传质过程加快,有效成分的溶出也加快。我们采用超声法对枳椇子总黄酮进行单因素及正交试验,优选出枳椇子中芦丁的最佳提取方案[9]。与常见方法相比,省时、高效、节能、简便、易行。将其用于提取当中,选出最佳提取工艺,对枳椇子的开发利用有重要的现实意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UV755B紫外全波长扫描仪(上海奥析科学仪器有限公司);紫外―可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司);JY-3002电子天平(福州华志科学仪器有限公司);AB135-S型电子分析天平(瑞士Mettler Toledo仪器公司);KQ-300型超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司);SHB-IIIA型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);DFY-250摇摆式高速中药粉碎机(上海隆拓仪器设备有限公司); GZX-DH-50X5S-Ⅱ电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂)。

1.2 材料

芦丁标准品(中国药品生物制品检定所,批号: 100080―201307);枳椇子(河南禹州药材批发市场);甲醇(天津四友精细化学品有限公司,批号:402086―06650);乙醇(安徽安特食品股份有限公司,批号: 20131007);石油醚60～90℃(天津市富宇精细化工有限公司);氯化铝(武汉云曦化工有限责任公司)。

2 实验方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精称干燥至恒重的芦丁标准品1.50 mg于25 m L容量瓶中,加甲醇超声溶解并定容至刻度, (C=60.00μg/m L)。

2.2 供试品溶液的制备

称枳椇子(20～40目)10.00 g,加入14倍体积分数70%乙醇水溶液,超声提取(功率:160 W、温度: 70℃下、时间:60 min),抽滤,石油醚(60～90℃)脱脂后,精密吸取4.0 m L加入2.0 m L的10 g/L AlCl3乙醇溶液,用体积分数70%乙醇溶液定容至25 m L容量瓶中,室温静置20 min,待测。

2.3 芦丁最大吸收波长的确定

精密吸取“2.1项”芦丁标准品1.5 m L加2 m L的10 g/L AlCl3乙醇溶液,超声混匀,甲醇定容至10 m L容量瓶,室温静置20 min,得浓度为8.76μg/m L的标准溶液,以甲醇为空白对照予200～800 nm波长范围内测定吸光度,见图1。

图1 芦丁全波长扫描图

如图1所示,波长在274 nm和417 nm处有2个最大吸收峰,波长417 nm处吸收峰斜率比274 nm处小,波长偏差Δλ对应的吸光度偏差ΔA比其他区域小,实验误差相对较小。实验中以417 nm为最大吸收波长。

2.4 芦丁标准曲线的绘制

精密吸取芦丁标准溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 m L,加入2.0 m L的10 g/L AlCl3乙醇溶液,超声混匀,静置5 min,体积分数70%乙醇定容至10 m L,超声混合均匀,静置20 min。对吸光度和浓度作图,标准曲线如图2所示,得标准曲线方程A= 0.033 3C―0.022 3,r=0.999 3,线性范围在5.84～23.36μg/m L,线性良好。

图2 芦丁标准曲线

2.5 方法学验证

2.5.1 精密度实验 取“2.1项”母液2 m L,加2 m L的10 g/L AlCl3乙醇溶液,超声混匀,静置5 min,体积分数70%乙醇溶液稀释至10 m L容量瓶,混合均匀,室温静置20 min,在波长417 nm处测吸光度A,重复6次,计算得RSD=0.37%,表明仪器精密度良好,结果见表1。

表1 精密度试验结果(n=6)

2.5.2 重复性实验 称取枳椇子药材(20～40目)颗粒10.00 g,按照“2.2项”制备供试品溶液,在417 nm处测吸光度,测定6次,计算得RSD=0.73%,表明此方法重复性良好,结果见表2。

表2 重复性试验结果(n=6)

2.5.3 稳定性实验 称取枳椇子药材(20～40目) 10.00 g,按照“2.2项”制备供试品溶液,在417 nm处测吸光度,于0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h测定1次,计算得RSD=1.64%,枳椇子样品溶液在4 h内稳定性良好,结果见表3。

表3 稳定性试验结果(n=8)

2.5.4 加样回收实验 精密称取枳椇子药材(20～40目)的干燥提取物18.64 mg加体积分数70%乙醇定容至50 m L,于417 nm处测其吸光度:A(样)= 0.312(c=10.04μg/m L),取芦丁标准溶液,于417 nm处测其吸光度:A(标)=0.363(c= 11.57μg/m L)。精密量取上述的枳椇子样品溶液(10.04μg/m L)9份各1 m L,并将其分为3组,按 1∶0.8、1∶1、1∶2三个梯度分别加入上述的对照品溶液(11.57μg/m L),按照“2.2项”进行显色操作,于417 nm处测其吸光度A,计算平均回收率为96.92%,RSD=1.73%。表明误差和操作过程中的损失在限度范围内,该实验方法比较可靠,结果见表4。

表4 加样回收试验结果(n=9)

2.6 总黄酮超声提取工艺的优选

2.6.1 单因素实验考察 ①原料目数:精密称取枳椇子药材10.00 g,共5份,枳椇子原料目数为10～20目、20～40目、40～60目、60～80、80～100目,分别加入12倍量体积分数70%乙醇溶液,于60℃、功率128 W下超声提取60 min,按2.2项下方法制备供试品溶液,在417 nm处测吸光度,计算芦丁提取率分别为:0.64、0.79、0.84、0.73、0.67 mg/g。故选择过40～60目筛。②乙醇浓度:精密称取(过40～60目筛)枳椇子药材10.00 g,共5份,分别加入12倍量体积分数50%、60%、70%、80%、95%的乙醇溶液,于60℃、超声功率为128 W条件下超声提取60 min,按2.2项下方法制备供试品溶液,在417 nm处测吸光度,计算芦丁提取率分别为:0.70,0.72,0.74,0.69, 0.65 mg/g。应选择体积分数70%乙醇。③料液比:精密称取(过40～60目筛)枳椇子药材10.00 g,共5份,分别加入6,8,10,12,14倍量体积分数70%乙醇,于60℃、超声功率为128 W条件下超声提取60 min,按2.2项下方法制备供试品溶液,在417 nm处测吸光度,计算芦丁提取率分别为:0.64,0.68,0.70,0.81,0.73 mg/g。故选择料液比为1∶12。④超声温度:精密称取(过40～60目筛)枳椇子药材10.00 g,共5份,分别加入12倍量体积分数70%乙醇溶液,超声功率为128W,分别于30、40、50、60、70℃下超声提取60 min,按2.2项下方法制备供试品溶液,在417 nm处测吸光度,计算芦丁提取率分别为:0.52,0.64,0.66,1.03,0.73 mg/g。故选择超声温度为60℃。⑤超声时间:精密称取(过40～60目筛)枳椇子药材10.00 g,共5份,分别加入12倍量体积分数70%乙醇溶液,于60℃、128 W下,依次提取15、30、60、90、120 min,按2.2项下方法制备供试品溶液,在417 nm处测吸光度,计算芦丁提取率分别为:0.53,0.69,0.84,0.73,072 mg/g。故选择超声时间60 min。⑥超声功率:精密称取(过40～60目筛)枳椇子药材10.00 g,共5份,分别加入12倍量体积分数70%乙醇溶液,于60℃下,超声功率分别为64、96、128、160、200 W下提取60 min,按2.2项下方法制备供试品溶液,在417 nm处测吸光度,计算芦丁提取率分别为:0.70、0.72、0.79、0.75、0.74 mg/g。故选择超声功率128 W。

2.6.2 超声提取工艺的优化 结合上述的单因素考察的结果及实际情况,选择超声温度、超声功率、料液比、原料目数4个因素,每个因素选取3个水平,如表5所示。以芦丁含量为考察指标,按L9(34)进行正交试验,如表6所示。确定最佳提取工艺。方差分析结果如表7。

表5 正交实验考察因素

表6 超声提取正交实验结果(n=9)

表7 方差分析结果(α=0.05)

按上述正交表的要求称取干燥后的不同目数范围的枳椇子药材10.00 g,共9份,进行实验,按照“2.2项”配制供试品,于417 nm处测定芦丁含量,结果见上表。超声法提取芦丁的工艺中超声温度对提取率的影响最为显著,其影响程度大小顺序为:A＞C＞D＞B,枳椇子中芦丁最佳提取工艺为:A3B3C3D1,超声温度:70℃、超声功率:160 W、料液比:1∶14、原料目数:20～40目。

2.7 验证实验

称取干燥后的枳椇子药材颗粒(20～40目) 10.00 g,3份,按正交表中的最优方案提取枳椇子中的芦丁,按照“2.2项”配制供试品,于417 nm处测定芦丁含量,三批结果见表8。

表8 样品中芦丁含量的测定

3 结论

我们实验通过对多种影响因素的考察,得出提取枳椇子总黄酮的最佳提取工艺:P=160 W、T= 70℃、料∶液=1∶14、原料目数=20～40(目),体积分数70%乙醇溶液为提取溶剂,超声1 h。按照“2.2项”配制供试品,于417 nm处测定芦丁含量。测得含量为1.17 mg/g。

4 讨论

黄酮类化合物芦丁分子结构中5'、3'、4'上有羟基,可用10 g/L AlCl3或Al(NO3)3溶液为显色剂,由于枳椇子中芦丁的含量较低,后者使用时要加入NaOH溶液(使芦丁水解)测定的结果误差较大,除此之外,硝酸根有氧化性。而用10 g/L AlCl3的乙醇溶液为显色剂,干扰较小、显色较灵敏、操作简单,适用于定量分析。所以我们实验用10 g/L AlCl3乙醇溶液为显色剂。我们实验中还考察了显色时间、显色剂的量对含量测定的影响,结果表明,加入显色剂2 m L、20 min后,测量值基本不变。所以实验中选用2 m L显色剂,显色20 min后测定其含量,结果较为准确。我们实验用的对照品为芦丁,主要是由于芦丁在黄酮类化合物中具有代表性,相对来说是价格便宜、容易得到的对照品;而芦丁在枳椇子中的含量并不高,所以实验中应根据芦丁的理化性质严格控制实验条件,尽可能的降低实验误差,从而得到较准确的实验结果。

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[责任编辑 李武营]

Optimizing the Ultrasonic Extracting method of Total Flavonoids from Hovenia dulcis Thunb by Orthogonal Design

TIAN Zhiyong，CHAI Zheng，XU Yafei，ZHAO Jingjing，LING Chunsheng*
（Phɑrmɑceuticɑl College of Henɑn University，Kɑifeng，Henɑn 475004，Chinɑ）

Objectiveto optimize the extracting method of total flavonoids from TurnjujubeMethodsextracting total flavonoids from Turnjujube by ultrasonication extraction，considering the size of raw material，material-toliquid ratio，extraction temperature，extraction frequency as affecting factor by L9（34）orthogonal design；using rutimun as a reference substance，the rutimun in Turnjujube was determined by UV absorption wave at 417 nm.Resultsthe best extraction condition by ultrasonication extraction was to use 70%alcohol at 70℃for 1 hours with 160W，material-to-liquid ratio 20～40 mesh granule，and the resultant total flavonoids yield was 1.17mg/g，equation of regression：A=0.033 3C―0.022 3（r=0.999 3），the linearity of rutimun was obtained with in the range of 5.84～23.36μg/m L，the average recovery was 96.92%.Conclusionthe method is convenient and reliable，this result provide a suitable method research.

Hovenia dulcis Thunb；Total flavonoids；Rutin；Ultrasonic extraction

TQ460.6

A

1672―7606(2015)04―0247―05

2015-08-12

田智勇,(1968―),男,河南南阳人,博士,副教授,从事药物化学教学与研究工作。

*通信作者:凌春生(1957―),男,河南周口人,硕士,副教授,硕士生导师,从事药物制剂教学与的研究工作。