刘 韩，刘应高，李姝江，帅 伟，刘燕云

(1 四川省甘孜州林业科学研究所，四川 康定 626001；2 四川农业大学 林学院，四川 成都 611130)

四川松树内生拟盘多毛孢的多样性及其防病效果

刘 韩1,2，刘应高2，李姝江2，帅 伟1，刘燕云1

(1 四川省甘孜州林业科学研究所，四川 康定 626001；2 四川农业大学 林学院，四川 成都 611130)

【目的】 对四川松树内生拟盘多毛孢Pestalotiopsis的生态分布及其对松树病害的防治效果进行分析，为松树病害无公害治理提供理论与实践基础。【方法】 对分布于四川的松树内生拟盘多毛孢的多样性进行调查统计，分析树种、松树组织、海拔和季节对内生拟盘多毛孢定殖率、Shannon-Weiner指数和相似性指数的影响。在此基础上，筛选对松落针病菌、烂皮病菌、赤枯病菌有拮抗作用的内生拟盘多毛孢，浸渍法检测其对松针的致病性，采用喷雾法和针刺法分别对室内盆栽湿地松苗接种拮抗菌和3种病原菌，计算发病率、病情指数和防治效果。【结果】 湿地松、马尾松、火炬松中内生拟盘多毛孢的多样性明显高于华山松和云南松，内生拟盘多毛孢在针叶中的分布多于枝和干，其多样性在海拔较低地区(400～600 m)相对较高，不同季节则以春季多样性最高。此外，散沫拟盘多毛孢(P.lawsoniae)、小孢拟盘多毛孢(P.microspor)和石楠拟盘多毛孢(P.photiniae)对松落针病菌、松烂皮病菌、松赤枯病菌3种病原均有拮抗作用，抑制率达38.49%～77.42%，其中P.lawsoniae的作用最为明显，且在致病性测定中对松针无伤害作用。室内对湿地松苗病害的防治试验中，P.lawsoniae孢子原液及稀释液(50倍液和500倍液)对3种病害均表现出了较好的防治效果，防治效果达40.90%～89.77%。【结论】 松树内生拟盘多毛孢资源丰富，对松树病害具有生物防治潜力，其中P.lawsoniae对松树落针病、烂皮病和赤枯病具有良好的生防前景。

内生拟盘多毛孢；多样性；松树病害；生物防治

内生真菌作为一类特殊而普遍存在于植物组织内的类群，可以与宿主建立一系列复杂的包括互惠、拮抗和中性且三者之间可以相互转化的关系[1]，有极大的科学研究价值和开发利用潜力。拟盘多毛孢(Pestalotiopsis)作为植物内生真菌的重要类群，长期以来被当作植物病原菌[2-5]进行研究。目前，对该菌的研究主要集中在分类学[6-7]、生物学特性[8]及活性次生代谢物质[9-10]等方面，也有关于其在壳斗科、樟科、棕榈科植物中多样性的报道[11]，但作为四川分布最广且最为重要的造林树种之一的松树，针对其内生拟盘多毛孢多样性及生态分布的系统性研究尚属空白。

落针病、烂皮病、赤枯病都是对松树为害严重的病害，受害树种可达十余种，从苗木、幼树到成年树均可受害，重者可致成片松树死亡，给许多林区造成了重大损失，目前对3种病害防治方法的报道主要是营林措施和化学药剂施用[12-14]，但化学防治往往会产生巨大药害。随着无污染、低成本、作用持久的生物农药在植物病害防治中的广泛应用，越来越多的学者采用有益微生物对松树病害进行防治。诸如利用木霉对松落针病[15]、松烂皮病[16]的初步抑菌研究及用绿粘帚霉与坚强芽孢杆菌对松赤枯病的协同控制研究[17]等。有报道指出[18]，内生拟盘多毛孢对苹果炭疽病菌(Glomerellacingulata)、番茄灰霉病菌(Botrytiscirerea)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)等6种植物病原真菌有较强的抑制作用，但松树内生拟盘多毛孢对松树本身病害的防治效果至今尚未见报道。本试验在前期对四川松树内生拟盘多毛孢分离鉴定[19]的基础上，探讨内生拟盘多毛孢在不同松树种、松树不同组织、不同季节和不同海拔的分布规律，同时从内生拟盘多毛孢资源中筛选对松树病害病原有良好拮抗作用的菌株，并将其应用于病害的生物防治中，以期为松树病害的无公害治理提供重要的理论与实践依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试拟盘多毛孢 从四川松树林区采集的湿地松(PinuselliotiiEngelm)、马尾松(PinusmassonianaLanb.)、云南松(PinusyunnanensisFaranch)、华山松(PinusarmandiiFranch.)和火炬松(PinustaedaLinn.)松树样本上分离得到11种内生拟盘多毛孢[19]，即雕刻拟盘多毛孢(Pestalotiopsiscarver(Guba) P.L.Zhu,Q.X.Ge & T.Xu)、木防已拟盘多毛孢(Pestalotiopsiscocculi(Guba) G.C.Zhao & Li.)、山桃草拟盘多毛孢(Pestalotiopsisgaurae(Guba) A.R.Liu,T.Xu & L.D.Guo,comb.nov.)、异角状拟盘多毛孢(Pestalotiopsisheterocornis(Guba) Y.X.Chen & G.Wei)、散沫拟盘多毛孢(Pestalotiopsislawsoniae(Mundk. & Kheswalla) Y.X.Chen)、胡枝子拟盘多毛孢(Pestalotiopsislespedezae(Sydow) Bilgrami)、小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsismicrospora(Speg.) Batista & Peres)、忽视拟盘多毛孢(Pestalotiopsisneglecta(Thüm.) Steyaert)、橄榄色拟盘多毛孢(Pestalotiopsisolivacea(Guba) G.C.Zhao & J.He)、石楠拟盘多毛孢(Pestalotiopsisphotiniae(Thüm.) Y.X.Chen)和尤韦可拟盘多毛孢(Pestalotiopsisuvicola(Speg.) Steyaert)。

1.1.2 供试病原菌 包括松落针病菌(Lophodermiumpinastri(Schrad.ex Fr.) Chev)、松烂皮病菌(CenangiumferruginosumFr.ex Fr.)、松赤枯病菌(Pestalotiopsisfunereal(Desm.) Steyaert)，由四川农业大学森林保护省级重点实验室提供。

1.2 内生拟盘多毛孢的多样性分析

按照不同松树种、松树不同组织(枝、叶、干)、不同季节(春、夏、秋、冬)和不同海拔高度(400，500，600，2 000 m)，对获得的松树内生拟盘多毛孢菌株进行统计。

1.3 内生拟盘多毛孢的抑菌活性

采用平板对峙法[20]测定11种内生拟盘多毛孢的抑菌活性，每株内生菌重复3次，培养5d后测量病菌生长半径，按下式计算菌落生长抑制率：菌落生长抑制率=(对照菌落净生长半径-处理菌落生长趋向半径)/对照菌落净生长半径×100%；以此为依据筛选出拮抗效果最佳的拟盘多毛孢菌。

1.4 3种拮抗内生拟盘多毛孢对松针的致病性

1.4.1 菌悬液的准备 将对3种病原菌有拮抗作用的内生拟盘多毛孢接种于PDA平板上，25～28 ℃培养，产孢后用无菌水配成孢子悬液(104CFU/mL)备用。

1.4.2 致病性测定 选取3年生湿地松为试验对象。采用浸渍法[21]，称取去除针鞘的整条松针0.5g(5～7枝)，体积分数75%酒精消毒10s后，用无菌水清洗3次，然后向保鲜膜封口的1.5mL无菌离心管中加入1mL孢子液，使松针基部浸入其中。设原液、稀释50倍液、稀释500倍液3个梯度，以未接菌的培养液(CK1)和无菌水(CK2)为对照。25 ℃培养箱中培养，每处理重复3次。于培养24，48，72h观察记载致病情况，伤害级别分为5级(0～4)：0，无明显反应，针叶与对照差别不大；1，1/4以下的针叶出现症状；2，1/4～1/2的针叶出现症状；3，1/2～2/3 的针叶出现症状； 4，2/3以上的针叶出现症状。级别数值越大表示所受伤害越严重。

1.5 散沫拟盘多毛孢对松树病害的防治试验

1.5.1 散沫拟盘多毛孢和病原菌悬液的准备 将散沫拟盘多毛孢和3种病原菌分别接种于PDA平板上，25～28 °C培养，产孢后用无菌水配成孢子悬液(104CFU/mL)备用。

1.5.2 散沫拟盘多毛孢与病原菌的接种与处理 以3年生盆栽湿地松为试验对象，将散沫拟盘多毛孢孢子液采用喷雾法对种苗进行喷雾，每隔7d喷施1次，共3次。设原液、稀释50倍液、稀释500倍液3个梯度，以无菌水为对照，每处理30盆。1个月后采用针刺接种法[22]将烂皮病菌悬液接种于幼苗的枝干处，将落针病菌和赤枯病菌悬液接种于针叶处，每处理接种100个点，并对接种部位进行保湿。

病原菌接种30d后，按下列方法进行病害调查统计，并计算发病率、病情指数和防治效果。病害分级标准为：0级，无病斑；1级，发病枝条比例或病斑占针叶比例1/3以下；2级，发病枝条比例或病斑占针叶比例为1/3～2/3；3级，发病枝条比例或病斑占针叶比例为2/3～4/5；4级，整株死亡。计算公式为：发病率(%)=(发病部位数/总接种部位数)；病情指数=[(各病级数×代表级值)/(总数×发病最高的病级数)]×100；防治效果(%)=[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]。

1.6 数据分析

试验数据采用Excel2010和SPSS13.0软件分析处理，用LSD法进行差异显著性多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 松树内生拟盘多毛孢的多样性

2.1.1 松树种的影响 表1结果显示，5种不同松树间内生拟盘多毛孢的组成差异较大。从分离获得的内生拟盘多毛孢菌株数量和种数来看，马尾松、湿地松分别获得了82株和71株目标菌株，而华山松只分离到8株；湿地松上分离到了所有11种中的10种，而华山松和云南松上只分离到了2种。在定殖率的统计分析中，目标菌株在马尾松、湿地松和火炬松中的定殖率显著高于云南松、华山松。从Shannon-Weiner多样性指数来看，5种松树内生拟盘多毛孢种的Shannon-Weiner指数从高到低的顺序依次为湿地松>马尾松>火炬松>云南松和华山松。在分离到的11个种中，湿地松上有2个种是其他松树上没有分离到的，而火炬松也有1个种是独有的，并且只分离到1株。

由表2可以看出，马尾松、湿地松和火炬松间内生拟盘多毛孢群落的相似性基本处于中等相似水平，相似性系数为0.5～0.75，而马尾松、湿地松、火炬松与华山松、云南松的相似性均为低相似水平，相似性系数低于0.5，华山松与云南松2种松树间的群落相似性系数为1，达到完全相似。由此可见，马尾松、湿地松、火炬松的内生拟盘多毛孢种组成差异较大，而云南松与华山松内生拟盘多毛孢种组成无差异，二者内生拟盘多毛孢群落相似性完全相同，并与其他松树种间存在较大差异。

表1 四川省不同松树种中内生拟盘多毛孢的多样性Table 1 Diversity of endophytic Pestalotiopsis from different pines in Sichuan

注：同列数据后标不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著(LSD法)。下同。

Note:DifferentlowercaselettersineachcolumnindicatesignificantdifferenceatP<0.05levelbyLSDtest.Thesamebelow.

表2 四川省不同松树种中内生拟盘多毛孢群落间的相似性系数Table 2 Similarity coefficients of endophytic Pestalotiopsis from different pines in Sichuan

2.1.2 松树组织的影响 由表3可知，松树内生拟盘多毛孢菌的分布具有明显的组织专化性，即目标菌株主要分布于松树的针叶中，其在叶部的定殖率显著高于枝和干，干的定殖率最低；3种松树组织中内生拟盘多毛孢的Shannon-Weiner多样性指数同样也以叶部最大。对3种松树组织间内生拟盘多毛孢群落相似性系数的分析结果(表4)显示，叶与枝、干的群落相似性系数分别为0.71和0.53，均处于中等相似水平；而枝与干的相似性系数为0.80，说明枝和干上分离到的内生拟盘多毛孢的种较为相似。

表3 不同松树组织间内生拟盘多毛孢的多样性Table 3 Diversity of endophytic Pestalotiopsis indifferent tissues of pines

表4 不同松树组织内生拟盘多毛孢群落间的相似性系数Table 4 Similarity coefficients of endophytic Pestalotiopsisfrom different pine tissues

2.1.3 海拔的影响 由表5可知，松树内生拟盘多毛孢菌的分布与海拔高度密切相关，垂直分布带谱明显。在海拔较低的地区(400～600m)，内生拟盘多毛孢菌种的数量和定殖率相对较高，定殖率和Shannon-Weiner多样性指数总体上均呈现出随海拔升高而升高的趋势；而在高海拔区域(2 000m)，定殖率和Shannon-Weiner多样性指数均显著低于其他区域。

表5 不同海拔松树内生拟盘多毛孢的多样性Table 5 Diversity of endophytic Pestalotiopsis of pines in different altitudes

表6 不同海拔松树内生拟盘多毛孢群落间的相似性系数Table 6 Similarity coefficients of endophytic Pestalotiopsisof pine in different altitudes

从群落的相似性系数(表6)来看，海拔2 000m与400～600m的相似性系数分别为0.20，0.22和0.21，均处于较低的相似水平。可见，高海拔地区松树内生拟盘多毛孢菌的物种多样性和定殖率均明显低于低海拔地区。

2.1.4 季节的影响 由表7可知，松树内生拟盘多毛孢的定殖率呈现出春季>秋季>夏季>冬季的趋势；其Shannon-Weiner多样性指数在春季为1.92，明显高于其他3个季节，且也显示出与定殖率一样的变化趋势，即春、秋季的多样性大于夏季和冬季。从不同季节内生拟盘多毛孢群落的相似性系数(表8)来看，春季、夏季和秋季间的群落相似性较高，相似性系数均大于0.75；而冬季与其他3个季节的相似性均处于0.5～0.6，属于中等相似水平。所以从群落相似性系数来看，松树内生拟盘多毛孢的分布随季节变化并不明显。

表7 不同季节松树内生拟盘多毛孢的多样性Table 7 Diversity of endophytic Pestalotiopsis ofpines in different seasons

表8 不同季节松树内生拟盘多毛孢群落间的相似性系数Table 8 Similarity coefficient of endophytic Pestalotiopsis ofpines in different seasons

2.2 内生拟盘多毛孢对松树病害病原的拮抗作用

将11种内生拟盘多毛孢菌与供试病原菌进行对峙培养，测量病菌趋向半径并计算抑制率，结果(表9)显示，散沫拟盘多毛孢(P.lawsoniae)、小孢拟盘多毛孢(P.microspor)和石楠拟盘多毛孢(P.photiniae)对3种病原均有一定的拮抗作用，抑制率都在35%以上，其余内生拟盘多毛孢对病原菌的抑制作用不明显。其中，P.lawsoniae对松落针病菌(L.pinastri)的抑制作用最为明显，抑制率高达77.42%，病原菌的生长被显著抑制，菌丝萎缩并有明显的拮抗带出现(图1)；其对松烂皮病菌(C.ferruginosum)和松赤枯病菌(P.funereal)的抑制率也均超过60%，且与其余拟盘多毛孢的抑制率差异显著。

表9 内生拟盘多毛孢对松树病害病原的拮抗作用Table 9 Antagonistic effect of endophytic Pestalotiopsis on pathogens of pines

注：数据均为3次重复的“平均值±标准差”。

Note:Dataare“means±SD”ofthreereplications.

2.3 3种拮抗内生拟盘多毛孢对湿地松的致病性

由表10可以看出，浸渍法检测中，3种内生拟盘多毛孢各处理几乎没有活性或活性较低。散沫拟盘多毛孢(P.lawsoniae)原液、50倍液、500倍液处理72h后均对松针无伤害(与无菌培养液和无菌水处理相同)；小孢拟盘多毛孢(P.microspor)和石楠拟盘多毛孢(P.photiniae)原液在处理72h时松针出现了一定的干蔫现象，且二者50倍液均有轻微伤害现象，甚至P.photiniae的500倍液也对松针有轻微伤害。由拮抗作用和致病性检测结果可知，散沫拟盘多毛孢(P.lawsoniae)适用于松树病害的防治。

图1 散沫拟盘多毛孢对松落针病菌的拮抗作用
A.松落针病菌(对照);B.散沫拟盘多毛孢与松落针病菌的对峙培养
Fig.1AntagonisticeffectofPestalotiopsis lawsoniaeonLophodermium pinastri
A.L.pinastri (CK);B.confrontcultureofP.lawsoniaewithL.pinastri

表10 3种拮抗内生拟盘多毛孢对湿地松的伤害级别Table 10 Injury grade of antagonistic endophytic Pestalotiopsis on Pinus elliotii

注：CK1.无菌培养液；CK2.无菌水。

Note:CK1.Sterileculturesolution;CK2.Sterilewater.

2.4 散沫拟盘多毛孢对松树病害的室内防治效果

由表11可知，接种3种病原菌30d后，散沫拟盘多毛孢对松树3种病害均表现出良好的保护效果，说明松树病原的定殖、生长受到了抑制，从而降低了病原菌危害寄主的几率。

表11 散沫拟盘多毛孢对松树病害的室内防治效果Table 11 Control effects of Pestalotiopsis lawsoniae on pine diseases in laboratory

注：各数据均为30次重复的“平均值±标准差”。CK.无菌水。

Note:Dataare“means±SD”ofthirtyreplications.CK.Sterilewater.

对松落针病菌(L.pinastri)，P.lawsoniae孢子原液和稀释液均表现出了很好的防治效果，防治效果超过60%；对松烂皮病菌(C.ferruginosum)的防治效果也均在50%以上，对松赤枯病菌(P.funereal)的防效大于40%。P.lawsoniae对3种病原的防治效果随其稀释倍数的增加而降低。因此，若将P.lawsoniae用于这3种病害的林间防治，对松落针病和松烂皮病可以施用500倍液，对松赤枯病应施用50倍液。

3 讨 论

本研究结果表明，松树内生拟盘多毛孢的多样性受松树种类、松树组织类型、海拔高度和季节的影响，其在湿地松、马尾松、火炬松上的定殖率明显高于华山松和云南松，结合Cannon等[23]、Jeewon等[24]的报道，说明内生拟盘多毛孢没有明显的宿主专一性。松树针叶中的内生拟盘多毛孢分布最多，多于枝、干，这一结果与李曼等[11]的研究结果不一致，可能是由于宿主不同，或者是内生真菌在植物不同器官和组织中占据有不同的生态位，而内生拟盘多毛孢的组织选择偏向性在松树上表现为叶片。本研究结果还表明，内生拟盘多毛孢的多样性有海拔差异性，这与王梅霞等[25]的研究结果一致，原因可能是内生真菌类群的分布除了受宿主植物种类的影响外，还受其他因素如地理位置、气候、环境、降雨量等外在条件的影响。在关于不同季节内生拟盘多毛孢的多样性研究中，Albrectsen等[26]认为其在春季多样性最高，可能是受当季的水分、温度相互作用的影响。由于影响内生拟盘多毛孢分布和组成的因素较多，机制也较为复杂，因此，宿主植物、内生真菌和环境之间的相互作用机制还需进一步探讨。

内生真菌与宿主之间形成了和谐的共生关系，利用内生真菌进行病害生物防治具有先天优势，这一理论已被普遍认同[27-28]。本研究利用分离自四川松树林区的11种松树内生拟盘多毛孢对松落针病、松烂皮病和松赤枯病进行拮抗作用试验，结果显示其中3种有抑菌活性，且对松落针病菌抑制作用较强，说明这3种松树内生拟盘多毛孢具有对松树病害进行生物防治的潜力，其中以散沫拟盘多毛孢(P.lawsoniae)的拮抗作用最强。目前有报道指出，散沫拟盘多毛孢(P.lawsoniae)和石楠拟盘多毛孢(P.hotiniae)对马尾松均有致病作用[7]，小孢拟盘多毛孢(P.microspor)为油茶叶枯病的病原[29]，结合本试验3种拟盘多毛孢的致病性测定结果，推测可能是某些拟盘多毛孢在不同植物或器官中可以表现为内生或病原状态，或者在一定条件下还可以转变，然而三者致病机制的异同还有待进一步探讨。就本试验中散沫拟盘多毛孢(P.lawsoniae)对松树3种病原菌的拮抗作用和致病性测定结果来看，该菌更适合于松树病害的生物防治。另外，在盆栽防治试验中，散沫拟盘多毛孢(P.lawsoniae)原液和稀释液对松落针病、烂皮病和赤枯病均有不同程度的防治效果；前期研究结果[19]显示，散沫拟盘多毛孢(P.lawsoniae)在5种松树上均能分离到，说明该菌在松树体内适生能力较强，这一特点是该菌用于防治松树病害的一大优势。由于内生拟盘多毛孢一直被作为病原菌进行研究，在病害生物防治上刚刚起步，本研究以散沫拟盘多毛孢(P.lawsoniae)作为生防材料尚属首次。下一步应深入研究该菌是否可以产生抑菌活性物质，进而探明其抑菌机理，为将其制成用于松树病害防治的高效、稳定、环保的生物制剂奠定基础。

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Diversity traits of endophyticPestalotiopsisfrom pine trees in Sichuan and its control effect

LIU Han1,2,LIU Ying-gao2,LI Shu-jiang2,SHUAI Wei1,LIU Yan-yun1

(1GanziInstituteofForestryResearch,Kangding,Sichuan626001,China; 2CollegeofForestry,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu,Sichuan611130,China)

【Objective】 Ecological distribution of endophyticPestalotiopsisfrom pine species in Sichuan and its control effect on pine diseases were analyzed to provide theoretical and practical basis for pollution-free control of pine diseases.【Method】 The diversity of endophyticPestalotiopsisfrom pine species in Sichuan was investigated,and the effects of species,tissues,altitudes,and seasons on colonization rate,Shannon-Weiner index, and coefficient similarity of endophyticPestalotiopsiswere analyzed.Then,endophyticPestalotiopsiswith resistance againstLophodermiumpinastri,CenangiumferruginosumandPestalotiopsisfunerealwere screened.The pathogenicity of endophyticPestalotiopsiswas determined by impregnation method.The antagonistic fungus and pathogen were inoculated inPinuselliotiiby spraying and needle-punching methods.Incidence,disease index,and control effect were also calculated.【Result】 EndophyticPestalotiopsisinPinuselliotii,Pinusmassoniana,Pinustaedahad significantly higher diversity than that inPinusarmandiiandPinusyunnanensis.Distribution of endophyticPestalotiopsiswas more in needles than in branches and stems.Highest endophytic diversity was found in low altitude (400-600 m) in spring.EndophyticP.lawsoniae,P.microsporeandP.photiniaeshowed antagonistic effect against three tested pine pathogens (L.pinastri,C.ferruginosumandP.funereal) with inhibition rates of 38.49%-77.42%.P.lawsoniaewas the most effective one without injure effect on needles in the pathogenicity determination.In the controlled experiment in laboratory,the spore stock solution and diluent solution (50 and 500 times) ofP.lawsoniaehad positive control effects against all three diseases with inhibition rates of 40.90%-89.77%.【Conclusion】 The endophytic species ofPestalotiopsisfrom the pine species were rich and potentially functional against pine diseases.P.lawsoniaewas a good candidate for the bio-control of the three pine diseases (L.pinastri,C.ferruginosumandP.funereal).

endophyticPestalotiopsis;diversity;pine disease;biocontrol

时间:2015-11-11 16:16

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.12.008

2014-04-18

四川省教育厅重点项目(09ZA068)

刘 韩(1983-)，女，四川金堂人，工程师，硕士，主要从事林木微生物资源及病害防治研究。 E-mail:sumer.lisj@gmail.com

S763.15

A

1671-9387(2015)12-0041-08

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151111.1616.016.html