刘永祥，崔 锦，程 伟，朱宽佑，姜东风

(1 河南牧业经济学院，河南 郑州 450046；2 河南省高校动物营养与饲料工程技术研究中心，河南 郑州 450046)

CLA对仔猪外周血T淋巴细胞的细胞毒活性影响

刘永祥1，2，崔 锦1，程 伟1，2，朱宽佑2，姜东风2

(1 河南牧业经济学院，河南 郑州 450046；2 河南省高校动物营养与饲料工程技术研究中心，河南 郑州 450046)

【目的】 研究日粮中添加共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)对仔猪外周血T淋巴细胞的细胞毒活性影响，为将CLA作为免疫调节剂调控动物机体的免疫力和应用于畜禽乃至人类的营养实践提供参考。【方法】 30头21日龄杜长大断奶健康仔猪按体质量相近、性别比例一致原则两两配对，随机分为对照组和CLA日粮组，分别喂给基础日粮和2%CLA日粮，每组5个重复，每个重复3头猪，63日龄时用肝素抗凝真空管前腔静脉采取血样，测定外周血T淋巴细胞亚群、细胞毒活性、穿孔素和颗粒酶B mRNA表达及脂肪酸组成。【结果】 日粮添加CLA不影响仔猪外周血T淋巴细胞CD3+、CD4+的数量(P>0.05)，但可显著提高CD8+T细胞总数(P<0.05)；与对照组相比， CLA组仔猪外周血T淋巴细胞细胞毒活性、穿孔素和颗粒酶B mRNA表达分别提高29.98%(P<0.01)，32.87%(P<0.01)和43.36%(P<0.01)；未添加CLA时，仔猪外周血T淋巴细胞几乎不含CLA，但CLA组仔猪外周血T淋巴细胞中CLA 含量达到 0.24% (P<0.01) 。【结论】 日粮添加2%CLA可提高仔猪外周血CD8+T淋巴细胞数，增强仔猪外周血T淋巴细胞细胞毒活性。

共轭亚油酸；仔猪；外周血淋巴细胞；细胞毒活性

共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)是指含有共轭双键的亚油酸的空间和几何异构体的一类化合物的总称，属多不饱和脂肪酸家族的成员，因其具有抗癌、预防心血管疾病和糖尿病、控制体质量等多种生理活性而日益引起人们的重视。在动物生产方面，人们致力于生产富含CLA的动物产品以满足人类健康的需求，同时可利用CLA的免疫调节作用缓解畜禽免疫应激，保证畜禽正常生长[1-2]。

在无外源刺激的情况下，日粮CLA诱导猪外周血CD8+T细胞，尤其是处于细胞免疫核心地位的TCRαβCD8αβ T细胞增殖，可增强特定CD8+T细胞介导的免疫功能[3]。Bassaganya-Riera等[4]研究表明，日粮CLA能减轻2型圆环病毒感染对仔猪外周血和脾脏组织淋巴细胞的耗竭，提高特异效应CD8+、CD25+T淋巴细胞的比例，还能有效减轻2型圆环病毒对猪肺脏等组织的损伤程度。刘永祥等[5]研究发现，日粮CLA可显著缓解注射细胞免疫抑制剂环孢霉素A引起的仔猪脾脏和外周血CD8+T细胞数的减少及白细胞介素(IL-2)活性的降低。

综上所述，日粮CLA与机体组织的CD8+T细胞活化、增殖及其免疫功能存在密切的关系。CD8+T淋巴细胞是细胞免疫的效应细胞，细胞毒活性是衡量其功能的重要指标，因此笔者推断日粮CLA影响仔猪外周血T淋巴细胞的细胞毒活性。为此，本试验检测CLA对仔猪外周血T淋巴细胞的细胞毒活性影响，以期进一步深化CLA活性机制的研究，为将CLA作为免疫调节剂调控动物机体的免疫力和应用于畜禽乃至人类的营养实践提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验动物 30头21日龄杜长大断奶健康仔猪由河南省益发猪场提供。仔猪的平均体质量为5.95±0.09 kg。

1.1.2 试剂及仪器 CLA由青岛澳海生物科技有限公司提供，纯度为80.8%。主要试剂：淋巴细胞分离液(上海博生生物科技有限公司)；RPMI-1640粉剂(Life Technologies,INC)； FITC标记的鼠抗猪CD3+抗体，PE标记的鼠抗猪CD4+、CD8+抗体(Southern Biotechnology Associates,Inc)；鼠抗猪CD3+和鼠抗人CD28+(Abnova生物公司)；LDH检测ELISA试剂盒(上海艾美捷科技有限公司)； TRIZOL(Invitrogen,Life,Technologies)；定量PCR试剂盒(SYBR Green PCR master Mix，ABI Company)；共轭亚油酸标样；脂肪酸混合标样。主要仪器设备：气相色谱仪HP6890(Wilmingten，配HP-INNOWA色谱柱，固定相为交联聚乙二醇)；高速冷冻离心机(800型，上海医疗器械公司)；实时荧光定量PCR检测仪(CFD-3220型，MJ公司，美国)；流式细胞仪(Beckman Coulter Corp., 美国)。

1.2 试验设计

断奶仔猪，按体质量相近、性别比例一致原则两两配对，随机分配到对照组和CLA日粮组，分别喂给基础日粮和2% CLA日粮。每组5个重复，每个重复3头猪。日粮按照猪的营养标准(NRC，1998)配制，CLA组以2% CLA替代等量豆油。试验在河南省益发猪场进行，试猪网床饲养，舍温保持在25～27 ℃。猪栏面积为2 m×2 m；不锈钢可调式料槽，乳头式饮水器供水。粉料饲喂，自由采食和饮水；按常规管理程序进行免疫和驱虫。试验期为42 d。试验基础日粮组成和营养水平见表1。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 生长性能 于试验开始(21 日龄)和结束(63 日龄)时，仔猪个体空腹18 h称质量，计算平均日增质量(ADG)，记录给料量和剩料量，计算料质量比，料质量比=饲料消耗量/体质量增加量。

1.3.2 外周血淋巴细胞的分离和T细胞亚群检测 在63 日龄时，用肝素抗凝真空管前腔静脉采血。取4 mL淋巴细胞分离液于10 mL离心管中，然后沿管壁加入3 mL血，2 500g离心30 min，取中间白细胞层约1 mL，加入3～5倍RPMI-1640 营养液，洗涤3 次，每次2 500g离心10 min，弃上清，将沉淀的细胞重悬于RPMI-1640 完全培养液，用台盼蓝染色，统计活细胞数(>95%)。

调整淋巴细胞液的细胞浓度为1×107mL-1。荧光标记CD单抗染色。淋巴细胞分离液与合适浓度的CD单抗混合后，于4 ℃、黑暗中孵育30 min。用流式细胞仪测定其分化抗原CD3+、CD4+和CD8+，每个样品至少分析1×104个有活力的细胞。

表1 供试基础日粮组成及其营养水平Table 1 Diet composition and nutrition level

注：*预混料为每kg日粮提供：维生素A 9 000 IU、维生素D32 500 IU、维生素E 20.0 IU、维生素K33.0 mg、维生素B11.5 mg、维生素B24.0 mg、维生素B63.0 mg、维生素B120.012 mg、烟酸 30.0 mg、泛酸 15.0 mg、叶酸 0.75 mg、生物素 0.05 mg、氯化胆碱 350 mg、铁 75.0 mg、铜 225.0 mg、锌 75.0 mg、锰 20.0 mg、碘 0.048 mg、硒0.04 mg。

Note:*premix provides following for per kilogram of complete feed:VA9 000 IU，VD32 500 IU，VE20.0 IU，VK33.0 mg，VB11.5 mg，VB24.0 mg，VB63.0 mg，VB120.012 mg，niacin 30.0 mg，pantothenic acid 15.0 mg，folic acid 0.75 mg，biotin 0.05 mg，choline chloride 350 mg,Fe 75.0 mg，Cu 225.0 mg，Zn 75.0 mg，Mn 20.0 mg，I 0.048 mg，and Se 0.04 mg.

1.3.3 外周血T淋巴细胞的细胞毒活性检测 用RPMI-1640完全培养液调整外周血T淋巴细胞浓度为2×105mL-1，接种到96孔培养板，加入鼠抗猪CD3+和鼠抗人CD28+(对猪有交叉反应)单克隆抗体至终质量浓度为5 ng/mL，37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养4 h。

采用乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)释放法检测外周血T淋巴细胞的细胞毒活性，以绵羊红细胞为靶细胞。在0.2 mL/孔的96孔培养板中，按照40∶1的数目比混合外周血T淋巴细胞与靶细胞，培养24 h后，500g离心15 min，收集无细胞上清液，试验设3个重复。通过以下公式计算特定的LDH释放率。LDH释放率=[(细胞毒性试验的LDH释放值-自发释放值)/(最大LDH释放值-自发释放值)]×100%。其中未加入效应细胞、靶细胞单独培养时，LDH的释放确定为自发释放。加入体积分数2%的Triton X-100的混合物时，LDH的释放定义为最大LDH释放。

1.3.4 外周血T淋巴细胞穿孔素、颗粒酶B mRNA检测 采用实时荧光PCR检测穿孔素和颗粒酶B mRNA的表达情况。外周血淋巴经鼠抗猪CD3+和鼠抗人CD28+(对猪有交叉反应)单克隆抗体激活后，用TRIZOL一步法抽提总RNA，反转录获得cDNA。取2 μL纯化的RNA (约2 μg) 加入反转录体系(1.25 μL M-MLV RT反转录酶(200 U，Introvgen Company)，1 μL的Oligo dT18 (30 mmol/L)，13 μL无RNA酶的双蒸水，1.25 μL 10 mmol/L dNTP，1 μL RNA酶抑制剂(50 U/μL))中，37 ℃保温60 min，70 ℃15 min灭活反转录酶。合成的cDNA于-20 ℃冻存。

根据GenBank发表的猪穿孔素基因mRNA序列(GenBank登录号：XM003483492)设计引物： 上游引物 5′-CGCCTACCTCAGGCTTATCTC-3′、 下游引物5′-CCTCGACAGTCAGGCAGT-3′。根据GenBank发表的猪颗粒酶B基因mRNA序列(GenBank登录号：AJ293742)设计引物：上游引物5′-TGGGGGACCCAGAGAGATTAAA-3′，下游引物5′-TTTCGTCCATAGGAGACAATGC-3′。根据GenBank发表的猪β-actin基因mRNA序列(GenBank登录号：AY 550069)设计引物：上游引物5′-TCTGGTGGTACCACAATGTACCCT-3′，下游引物5′-CCAGTAATTGGTACCGGCTCCTC-3′。

PCR反应体系为：cDNA 1 μL，上、下游引物(0.25 μmol/L)各0.6 μL，双蒸水(无RNA酶)5.3 μL， SYBR Green PCR master Mix 7.5 μL。扩增条件为：55 ℃ 2 min，94 ℃预变性10 min；94 ℃变性15 s，55～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。每样品设3个重复。

1.3.5 外周血T淋巴细胞脂肪酸组成检测 采用一步法抽提脂质[6]。取2 mL细胞悬液(1×107mL-1)于10 mL具塞试管中，加入1 mg/mL正己烷0.4 mL，置于振荡器上振荡后静置10 min，然后加入0.6 mL甲酯化试剂(V(氯乙酰)∶V(甲醇)=1∶10)，盖上盖子于振荡器上振荡20 s，80 ℃水浴3 h，取出，冷却，加入1 mL体积分数7%～8%的K2CO3溶液，再加入0.4 mL正己烷，振荡，静置分层，取出上清液0.5 mL用于气相色谱分析。气相色谱条件：炉温200 ℃保持10 min，然后以100 ℃/min 的速度升至220 ℃，保持6 min，再以20 ℃/min 的速度升至230 ℃，保持1.5 min；氮气3 mL/min；监测器温度200 ℃，进样口温度250 ℃，进样量1 μL。

1.4 数据处理

试验数据表示为“平均值±标准差(SD)”,采用SPSS11.5统计分析软件进行t检验。

2 结果与分析

2.1 CLA对仔猪生长性能的影响

从表2可看出，日粮中添加CLA后，两组仔猪的平均日增质量和平均日采食量没有显著差异(P>0.05)；与对照组相比，CLA组仔猪的料质量比降低了6.28%(P<0.05)，说明日粮添加CLA改善了仔猪的饲料转化率。

表2 日粮添加CLA对仔猪平均日增质量、平均日采食量和料质量比的影响Table 2 Effects of dietary CLA supplementation on average daily gain,average daily feed intake and feed conversion efficiency of piglets

注：同列数据后标不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)，标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。

Note:Different lowercase letters within each column mean significant difference (P<0.05),Different capital letters within each column mean extremely significant difference (P<0.01).The same below.

2.2 CLA对仔猪外周血T淋巴细胞亚群的影响

由表3可知，日粮添加CLA对仔猪外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞的数量没有显著影响(P>0.05)，但显著提高了仔猪外周血CD8+T细胞总数(P<0.05)。

表3 日粮添加CLA对仔猪外周血T淋巴细胞亚群的影响 Table 3 Effects of dietary CLA supplementation on peripheral blood T lymphocyte subsets of piglets 个/μL

2.3 CLA对仔猪外周血T淋巴细胞细胞毒活性及穿孔素、颗粒酶B mRNA表达的影响

从表4可以看出，与对照组相比， CLA组仔猪外周血T淋巴细胞细胞毒活性、穿孔素和颗粒酶B mRNA表达分别提高29.98%(P<0.01)，32.87%(P<0.01)和43.36%(P<0.01)。

表4 日粮添加CLA对仔猪外周血T淋巴细胞细胞毒活性及穿孔素和颗粒酶B mRNA表达的影响Table 4 Effects of dietary CLA supplementation on peripheral blood lymphocyte cytotoxicity and perforin,granzyme B mRNA gene expressions in piglets

2.4 CLA对仔猪外周血T淋巴细胞脂肪酸组成的影响

日粮添加CLA对63 日龄仔猪外周血T淋巴细胞脂肪酸组成的影响见表5。由表5可见，外周血T淋巴细胞的主要脂肪酸是C18:0、C16:0、C18:1、C18:2、C20:4、C22:5，日粮添加CLA可显著提高C16:0 的含量(P<0.05)，显著减少C18:1 的含量(P<0.05)，但未显著改变其他主要脂肪酸的含量(P>0.05)；在未添加CLA的情况下，外周血淋巴细胞几乎不含有CLA，日粮添加CLA后，外周血淋巴细胞中CLA 含量达到 0.24%，极显著(P<0.01)高于对照组。

3 讨 论

现代养猪生产中，因病毒性疾病导致猪的免疫抑制现象越来越普遍，是猪对疾病越来越易感和免疫失败的重要原因之一。如何增强猪的免疫反应以提高其对病毒性疫病的抵抗力是行业关注的焦点。随着对营养抗病原理认识的深入和营养抗病技术的建立，通过增加营养改善猪的免疫反应是研究方向之一。本研究发现，日粮添加CLA可提高仔猪外周血淋巴细胞CD8+T细胞的数目和细胞毒活性，这可能意味着仔猪在保护性免疫反应中对病毒感染的抵抗力增强。

表5 日粮添加CLA对仔猪外周血T淋巴细胞脂肪酸组成的影响Table 5 Effects of dietary CLA supplementation on the fatty acid profile of peripheral blood lymphocyte of piglets %

注:同行数据后标注不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)，标不同大写字母表示差异极显著 (P<0.01)。

Note:Different small letters within a line mean significant difference (P<0.05) and different capital letters within a line mean extremely significant difference (P<0.01).

3.1 日粮中添加CLA对仔猪生长性能的影响

在本试验条件下，日粮中添加2% CLA对仔猪的日增质量没有显著影响，但可显著改善仔猪的饲料转化效率(P<0.05)。前人关于CLA对猪生长性能影响的研究结果不尽一致，Sparks等[7]研究表明，生长育肥猪的饲料效率随日粮CLA添加量的提高呈二次曲线性提高，赖长华[8]的研究结论与此类似，然而Eggert等[9]研究显示，日粮添加CLA不影响2种阉公猪的饲料效率。Michael等[10]曾综述了14项研究的结果，其中11项研究结果表明日粮中添加CLA可改善猪的饲料效率；在这14项研究中，有10项研究结果表明日粮中添加CLA不影响猪的日增质量，2项研究显示CLA降低了猪的日增质量，2项研究显示CLA提高了猪的日增质量，可见本试验研究结果与大部分研究者的结论一致，即日粮中添加CLA不影响仔猪的日增质量，但显著改善仔猪的饲料转化效率。不同的研究结果可能与猪的品种、日粮成分、饲养环境等因素有关。Gatlin等[11]认为，不同研究结果的差异与CLA的时间效应有关。Bassaganya-Riera等[3]报道，不同阶段的猪对CLA的反应不同。

3.2 日粮中添加CLA对仔猪外周血T淋巴细胞亚群的影响

以往的研究表明，在缺乏外源刺激的情况下，日粮中添加CLA可提高猪、禽和鼠等动物的外周血、胸腺、脾脏CD8+T 淋巴细胞数[3,12-14]。在本试验条件下，日粮中添加CLA不影响仔猪外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞数量(P>0.05)，但显著提高了CD8+T淋巴细胞数量(P<0.05)。CD8+T 淋巴细胞是细胞免疫的效应细胞，可直接破坏被病毒感染的细胞，防止由Th1和Th2类CD4+T细胞介导的免疫损伤，在机体抵抗病毒感染的细胞免疫中发挥重要的作用。因此，提高外周血CD8+T淋巴细胞数意味着CLA可能有助于提高仔猪抵抗病毒(菌)感染的能力。

3.3 日粮中添加CLA对仔猪外周血T淋巴细胞细胞毒活性和穿孔素、颗粒酶的影响

本试验发现，日粮中添加CLA可显著提高仔猪外周血T淋巴细胞的溶血活性，说明仔猪外周血T淋巴细胞细胞毒活性增强(P<0.01)。Bassaganya-Riera等[3]研究发现，日粮CLA诱导猪外周血CD8+细胞尤其是处于细胞免疫核心位置的TCRαβCD8αβ T细胞增殖，增强外周血T淋巴细胞颗粒酶活性。在2型圆环病毒感染猪的试验中，日粮CLA可提高特异效应CD8+T细胞的比例，有效减轻了病毒对猪肺脏等组织的损伤程度[4]。上述研究共同表明，日粮CLA有助于提高仔猪机体组织T淋巴细胞细胞毒活性，这为利用日粮CLA增强仔猪的病毒性疫病抵抗力提供了依据。

穿孔素和颗粒酶是机体内具有细胞毒作用的效应分子，储存在细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞胞质颗粒中。提高穿孔素和颗粒酶的表达是T淋巴细胞杀伤靶细胞的途径。本试验中，与提高仔猪外周血T淋巴细胞溶血活性相对应，日粮CLA显著提高了仔猪外周血细胞穿孔素和颗粒酶B mRNA的表达(P<0.01)。

3.4 日粮CLA对细胞膜组成的影响

本试验中，对照组外周血T淋巴细胞几乎不含CLA，而CLA组外周血单核细胞CLA含量达0.24%，说明CLA作为多不饱和脂肪酸家族的成员，与其他的不饱和脂肪酸一样，可以在T淋巴细胞中沉积[15-16]。

越来越多的证据表明，不饱和脂肪酸可沉积入免疫细胞膜，改变细胞膜的脂肪酸组成、蛋白的分布及构象，促进细胞膜受体分子的活化，对随后的信号传导及细胞免疫功能的发挥具有重要影响[17]。在近年来CLA抗癌机制的研究中发现，日粮CLA可改变多种细胞膜的组成，改变膜偶联蛋白结构，通过GPCR/PLC/IP3/CaMKK/AMPK途径诱导癌细胞的凋亡[18]。因此，在本试验中，日粮CLA在仔猪外周血T淋巴细胞中的沉积可能意味着改变了淋巴细胞的生理生化特性和细胞信号传导，从而影响其免疫功能，当然这需要进一步的试验来验证。

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Effects of dietary CLA on cytotoxic activity of peripheral blood lymphocyte cells of piglets

LIU Yong-xiang1,2,CUI Jin1,CHENG Wei1,2,ZHU Kuan-you2,JIANG Dong-feng2

(1HenanUniversityofAnimalHusbandryandEconomy,Zhengzhou,Henan450046,China;2HenanUniversityEngineeringTechnologyResearchCenterofAnimalNutritionandFeed,Zhengzhou,Henan450046,China)

【Objective】 This study investigated the effects of dietary conjugated linoleic acid (CLA) on cytotoxic activity of peripheral blood lymphocyte cells of piglets.【Method】 Thirty Duroc×Large White×Landrace weaned piglets at age of 21 d were randomly allocated into two treatment groups and fed with control diet and 2% CLA diet,respectively.Each treatment had five replicates of 3 piglets.The blood samples were collected at the age of 63 d to detect peripheral blood lymphocyte subsets,lymphocyte cytotoxicity,mRNA expressions of perforin and granzyme B,and fatty acid composition of peripheral blood lymphocytes.【Result】 Dietary CLA did not influence the numbers of CD3+and CD4+T lymphocytes in peripheral blood of weaned piglets (P>0.05),but significantly increased the number of CD8+T lymphocytes (P<0.05).Dietary CLA increased cytotoxic activity,mRNA expressions of perforin and granzyme B in peripheral blood lymphocyte cells by 29.98% (P<0.01),32.87% (P<0.01) and 43.36% (P<0.01),respectively.Peripheral blood lymphocyte cells of control group contained no CLA,but dietary CLA group had the total CLA content of up to 0.24% in peripheral blood lymphocyte cells (P<0.01).【Conclusion】 Supplement of 2% dietary CLA increased the number of peripheral blood CD8+T lymphocyte and enhanced cytotoxic activity of peripheral blood lymphocyte cells.

conjugated linoleic acid;piglet;peripheral blood lymphocyte cells;cytotoxic activity

时间:2015-11-11 16:16

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.12.002

2014-04-04

河南省科技厅重点科技公关项目(082102110123)；郑州牧专博士基金项目(2007DSR003)

刘永祥(1969-)，男，山东成武人，副教授，博士，主要从事单胃动物营养研究。 E-mail:yxliu225@163.com

S816；S828

A

1671-9387(2015)12-0007-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151111.1616.004.html