孙 武，李宇翔，谢勇平，，黄志坚，李清禄，

(1.福建农林大学生命科学学院;2.福建农林大学食品科学学院;3.福建农林大学动物药物工程实验室，福建福州350002)

伴随着我国水产养殖业的迅猛发展，水产养殖病害的发生与蔓延已成为制约渔业增效、渔民增收的关键问题，其中以细菌性、病毒性疾病最为严重［1］.如鳗鱼、大黄鱼、甲鱼等各种肠炎，对虾的烂鳃、白斑、红体，甲鱼的鳃腺炎、白底板，黄鳝的脱粘、红头和大头病等病症，导致养殖中所使用的鱼用药物的种类和数量不断增多.然而抗生素、促生长剂和杀虫药等的大量使用带来了药物残留大、抗药性等问题［2］，危害人类健康，污染了环境，且效果不佳.因此无残留、无污染的中药制剂越来越受到重视，应用也日益广泛.

中药具有天然性、多功能性、无毒副、无残留性和无抗药性等诸多优点，尤其是多成分协同作用和改善生态微环境作用［3］.将中药用于预防和治疗水产养殖疾病，对减少鱼疾病，提高水产养殖经济效益具有重要意义，也将给我国水产养殖业带来深远的影响［4］.然而，目前中药散剂在水产养殖业病害防治过程中存在的问题和不足也明显地显现出来，如临床用药效果缓慢、药效不稳定等.可能原因是由于鱼类生理学上的特殊性，使药物在肠道中的滞留时间相对较其他动物短，有效成分在动物体内利用度很低，导致治疗效果差;其次可能是中药有效成分含量变化大，产品质量不可控制，药效不稳定.

中药材浸(提)取液可从根本上克服中药散剂的弊端.它通过各种现代浸(提)取技术将中药材中的有效成分提取分离出来，再根据需要进行复配，融合了中药组方和西药有效成分的理论精髓，其有效成分吸收快速、完全、生物利用度高、疗效快，完全可与西药媲美.中药颗粒剂就是以此为基础形成的中药制剂.中药颗粒剂在人体上应用比较普遍，有较多的优势，但在鱼用药物方面的应用还很少，几乎是空白.研究表明，由于中药颗粒剂毒副作用小，既可治病又可作为饲料添加剂预防疾病，同时水溶性好，使用方便，是一种较为理想的鱼用中药制剂.

参照中兽医理论和中药使用的经验处方，复方鱼用中药整肠颗粒由黄柏、黄连、白头翁和秦皮等中药材组成.根据方中黄柏、黄连、白头翁和秦皮的功效特点［5－11］组成方剂，有整肠洗肠、促进肠道蠕动、改善肠道微环境、消炎抗病毒的功效.由于方剂中盐酸小檗碱是抑菌的主要活性成分，本试验以盐酸小檗碱为考察指标，研究黄柏、黄连、白头翁和秦皮较佳的制备工艺和颗粒产品的稳定性、安全性和临床应用的有效性等性能，旨在为制定产品的质量标准和扩大中药在水产养殖领域中的应用提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

中药材黄柏、黄连、秦皮和白头翁等均购于福建同春药业有限公司.

菌株:肠型点状气单胞菌(Aeromonas punotata f.intestinalis)、温和气单胞菌(A.sobria)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和嗜水气单胞菌(A.hydrophila)，均来源于农业部渔业动植物病原库.

试剂有盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所)、乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、超纯水，其他试剂均为分析纯.

主要仪器与设备有Waters Breeze 1525高效液相色谱仪(美国Waters公司)、KQ3200DE超声波清洗器(苏州昆山市超声仪器有限公司)、BP211D电子天平(北京塞多利斯天平有限公司)、超净台、高压灭菌锅、培养箱等.

1.2 产品制备

1.2.1 水提工艺 将105 g白头翁、150 g黄柏、60 g黄连和50 g秦皮4味药材混合，根据4味药材主成分均为水溶性的特点，提取工艺定为水提.经正交试验(略)得到最佳工艺为:将药材混合加入约12倍的水煎煮2次，每次1 h，滤过.合并滤液并将其浓缩成稠浸膏(80℃热测稠浸膏的比重为1.30－1.35)，备用.

1.2.2 颗粒制备 称取80 g糖粉和80 g糊精倒入适当的容器中，混合均匀，再加入240 g糖粉混合均匀.称取65 g稠浸膏倒入上述辅料，搅拌均匀，调整软材的软硬度，然后挤压过12目筛制成湿颗粒.

1.2.3 干燥、整粒 湿颗粒制成后，摊于洁净的搪瓷盘中，放入烘箱于60－80℃鼓风干燥，直至颗粒含水量达5.0%以下，然后过12目和60目筛进行整粒、包装.

1.3 盐酸小檗碱含量的测定

按高效液相色谱(high performance liquid chromatogram，HPLC)法［12］测定.

1.3.1 色谱条件 固定相:C18 柱，4.6 mm ×250 mm，5 μm;流动相:乙腈∶水 =50∶50(1000 mL 溶液中含3.4 g磷酸二氢钾和1.7 g十二烷基硫酸钠)，使用前用0.45 μm滤膜抽滤，超声脱气30 min;检测波长:346 nm;流速:1 mL·min－1;柱温:30℃;理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于2500.

1.3.2 盐酸小檗碱对照品和供试品溶液的制备 盐酸小檗碱对照品溶液配成含盐酸小檗碱50 μg·mL－1.

供试品溶液的配制:取复方鱼用中药整肠颗粒4 g，研细，过40目筛，精密称取筛下物2 g，加入30 mL甲醇，超声处理15 min，过滤，滤液用甲醇定容至50 mL容量瓶中.精密吸取2 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，即得.

1.3.3 样品测定 将对照品溶液配成含盐酸小檗碱含量分别为 0.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 和 30.0 μg·mL－1.分别吸取5 μL注入色谱仪，按“1.3.1”的色谱条件测定峰面积.以盐酸小檗碱含量对峰面积进行回归分析得回归方程.参照对照品溶液测定的方法，取供试品溶液5 μL，进样，记录峰面积，采用回归方程计算盐酸小檗碱的含量.

1.3.4 含量测定方法的验证 (1)精密度:精密吸取同一盐酸小檗碱对照品溶液5 μL，重复进样5针，记录各进针的峰面积.

(2)稳定性:精密吸取同一供试品溶液5 μL，分别于0、3、6、12、18和24 h各进样1次，测定盐酸小檗碱的峰面积.

(3)重现性:取同一生产批号的复方鱼用中药整肠颗粒6份，按“1.3.2”的方法制备样品液6份，按“1.3.3”的方法测定样品盐酸小檗碱的含量.

(4)加样回收率:称取已知含量的复方鱼用中药整肠颗粒6份，每份2.0000 g，分别加入盐酸小檗碱标准品1.00 mg，按“1.3.2”的方法进行样品前处理.按“1.3.3”的方法测定样品含量，计算回收率.

1.4 产品稳定性检测

1.4.1 光照试验 取3批产品，去除外包装直接倒入蒸发皿中，在(4500±500)lx强光下放置，5和10 d后取样测定.

1.4.2 温湿度加速试验 取3批产品，按市售包装，放置在(40±1)℃、相对湿度(75±5)%的条件下，每月取样分析，连续6个月.

1.4.3 长期试验 将3批产品放置于留样观察室内，室温下观察2年，试验期间分别于第3、6、9、12、15、18、21和24个月时观察其性状、鉴别、含量，并与0个月的数据相比较.

1.5 混饲喂服急性毒性的检测

采用半静水法进行.在水族箱中注入充分曝气的自来水200 L，每个水族箱分别饲养日本鳗鱼、甲鱼、黄鳝和南美白对虾20尾.将试验药物复方鱼用中药整肠颗粒溶解后均匀拌入饲料中，使药物浓度分别为10、20和30 g·kg－1，同时设定空白对照.每个剂量组设两个平行.试验期4 d，投饲量按体重的3%计，每天1次.试验期间观察并记录试验对象摄食、活动和死亡情况.

1.6 对鱼胃肠炎常见病原菌的抑制作用

1.6.1 培养基的配制 取10 g 蛋白胨、5 g 牛肉膏和5 g NaCl，加水至1000 mL，pH 7.2－7.4，于压力1.05 kg·cm－2、121 ℃下灭菌20 min.

1.6.2 抑菌圈直径的测定 采用平板扩散法将培养18 h的菌株用无菌水配制成约107cfu·mL－1的菌悬液，移取100 μL菌悬液至肉汁胨固体培养基上，涂布均匀，稍干后镊取牛津杯放于接种过菌株的平皿培养基表面，滴加200 μL药物，药液浓度为1 mg·L－1，于28℃恒温培养24 h后，用游标卡尺测量抑菌圈直径.

1.6.3 最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)的测定 采用对倍稀释法测定.供试药液浓度配成 5、2.5、1.25、0.625、0.313 和 0.156 μg·mL－1.

1.7 对鱼肠炎病治疗效果的检测

参照文献［13］的方法进行.造模成功后药物混饲喂服，饲料中的药物浓度为3 g·kg－1，连续投喂5 d，之后投喂正常的饲料，同时设定不喂服药物的对照.每组放草鱼20尾.试验期10 d.

2 结果与分析

2.1 样品中盐酸小檗碱含量的测定结果

对照品和样品的HPLC色谱图如图1所示，杂峰不干扰盐酸小檗碱吸收峰的测定.对照品含量测定的线性回归方程:Y=35929X，R=0.9991.盐酸小檗碱含量在5－30 μg·mL－1范围内呈良好的线性关系.方法精密度测定结果的RSD=0.368%;稳定性测定结果的RSD=0.397%;重现性测定结果的RSD=3.39%;加样回收率范围为97.68%－99.36%，平均98.48%，RSD=0.75%(n=6).用该法测定复方鱼用中药整肠颗粒样品6份，盐酸小檗碱含量平均值为2.02 mg·g－1，RSD=3.38%，说明方法的可信度高.

图1 复方鱼用中药整肠颗粒HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of compound Chinese medicinal bowel-care granule

2.2 产品稳定性

对3批产品进行了光照试验、加速试验和温室留样观察试验，经检验，性状、鉴别、含量等各项指标均无明显变化，说明本产品稳定性较好.

2.3 急性毒性

复方鱼用中药整肠颗粒混饲分别喂服日本鳗鱼、甲鱼、黄鳝和南美白对虾，结果表明，在设定的浓度范围内，日本鳗鱼、甲鱼、黄鳝和南美白对虾均未出现死亡及其他异常症状.根据安全浓度=96 h LC50×0.1，计算复方鱼用中药整肠颗粒对日本鳗鱼、甲鱼、黄鳝和南美白对虾的安全浓度均大于3 g·kg－1.

2.4 抑菌效果

从表1可以看出，1 mg·L－1复方鱼用中药整肠颗粒对肠型点状气单胞菌、鳗弧菌、温和气单胞菌和嗜水气单胞菌的平均抑菌圈直径分别为 15.4、18.5、13.6 和 13.7 mm.

表1 复方鱼用中药整肠颗粒对4株病原菌的抑菌圈直径Table 1 The antibacterial circle measurement of the bowel-care compound granules to 4 pathogenic strains

2.5 MIC 测定结果

复方鱼用中药整肠颗粒对肠型点状气单胞菌、鳗弧菌和嗜水气单胞菌的MIC均为0.625 μg·mL－1，对温和气单胞菌的 MIC 为 1.25 μg·mL－1.

2.6 对鱼肠炎病的治疗效果

复方鱼用中药整肠颗粒经混饲喂服(每公斤饲料添加3 g)给药治疗后，草鱼腹部膨大、红斑、肛门红肿突出、离群独游、不摄食和死鱼等现象明显减少，到第5天已无死亡个体，体色发黑的鱼也已少见.药物保护率见表2.3个试验组的保护率分别为42.9%、35.7%和57.1%，药物的平均保护率为45.2%.

表2 草鱼的死亡率Table 2 The average mortality of grass carp

3 结论

复方鱼用中药整肠颗粒产品的最佳提取工艺流程是经过正交试验得出的，本文省略了该试验过程.加速试验和长期试验的结果表明产品的稳定性较好.采用HPLC法对复方鱼用中药整肠颗粒中盐酸小檗碱的含量进行检测，其精密度、稳定性、重复性和加样回收率均符合要求，可作为复方鱼用中药整肠颗粒质量标准制定的参考.

复方鱼用中药整肠颗粒对鱼常见致病菌——肠型点状气单胞菌、鳗弧菌、温和气单胞菌和嗜水气单胞菌有较好的抑制作用，混饲喂服对日本鳗鱼、甲鱼、黄鳝和南美白对虾的安全浓度均大于3 g·kg－1，对胃肠炎病有一定的治疗效果，可用于鱼因细菌感染产生的急、慢性肠炎的治疗.

［1］曾令兵.我国水产养殖动物病害的现状及发展方向［J］.科学养鱼，2010(3):1－3.

［2］耿毅.水产养殖中药物残留的危害与控制(上)［J］.科学养鱼，2010(7):38.

［3］吴士顺.中药在水产养殖病害防治中的特点与优势［J］.天津水产，1999(4):42.

［4］田海军，郑曙明.渔用中草药复方的药效学研究概述［J］.水利渔业，2006，26(6):98－100.

［5］王莉.黄柏糊敷脐治疗溃疡性结肠炎［J］.中国康复，2006，21(3):186－186.

［6］汪松国，杨亚滨，丁忠涛，等.秦皮的研究进展［J］.国外医药:植物药分册，2010，22(3):108－111.

［7］方莲花，吕扬，杜冠华.秦皮的药理作用研究进展［J］.中国中药杂志，2008，33(23):2732－2736.

［8］胡隐恒，汪曼影.秦皮所含的秦皮素和秦皮甙的主要药理作用［J］.新医药学杂志，1975(8):41.

［9］王晓东，邓治文，彭晓华，等.秦皮总香豆素致突变作用研究［J］.药品评价，2004，1(3):194.

［10］陆树文，赵伟，李莉，等.白头翁汤治疗炎症性肠病的分子机制研究［J］.中国应用生理学杂志，2011(1):106－109.

［11］李仲兴，王秀华，赵建宏，等.用新方法进行黄柏对224株葡萄球菌的体外抗菌活性研究［J］.中医药信息，2000，10(5):33.

［12］高辉，徐丽华，崔丽华.RP-HPLC法测定肛安栓中盐酸小檗碱的含量［J］.中国药事，2011，25(9):927－935.

［13］农业部.渔药临床试验规范［J］.中国兽药杂志，2003，37(1):11－14.