吴 田，蓝增全

(1.西南林业大学园林学院;2.西南林业大学环境科学与工程学院，云南昆明650224)

乙烯是一种植物激素，高等植物器官一般都能产生乙烯，但不同组织、器官和发育时期乙烯的释放量不同，其主要生理作用是催熟、促衰老和促脱落.植物乙烯的生物合成过程为:蛋氨酸(Met)腺苷蛋氨酸(SAM )1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC )乙烯［1］，每一过程都在特定的酶催化下才能完成.ACC合成酶(ACC synthase，ACS)催化SAM形成ACC，是乙烯合成过程中重要的限速酶，具有重要的调控作用［2］.研究表明，ACS由多基因家族编码，有多种同工酶，其在植物组织中的含量很低，因而分离和提纯困难［3］.目前已在一些植物中克隆到该基因，如枣树［4］、茶树［5］、番茄［6］、桃［7］、香蕉［8］、猕猴桃［9］和薄皮甜瓜［10］等，通过研究并利用ACS基因达到了延迟成熟、保鲜和延长货架期的目的［11］.花朵的成熟衰老同果实一样，抑制乙烯的生成，也可以延缓一些花朵的衰老和凋谢［12］.因此，克隆植物的ACS基因，对延长花卉植物开花时间、调控开花时期及阐述开花植物乙烯合成的分子机理等具有十分重要的作用.

随着基因组学的发展，越来越多的植物基因组被测序.基因组学结合生物信息学，利用同源法克隆基因是一种非常有效的方法.简并PCR是20世纪90年代初建立的扩增DNA的方法，由于此种PCR不需要知道所要扩增DNA片段的核苷酸序列，因此该技术倍受青睐，广泛应用于新基因的克隆［13］.目前，用简并引物已经在水稻［14－15］、风信子［16］、黑莓［17］和树莓［17］等中成功克隆了一系列的基因.因此，根据已知的ACS基因序列，分析其保守区段并设计简并引物，是克隆植物ACS基因快速和有效的方法.本试验的目的旨在发掘克隆花卉植物ACS基因的通用引物，为进一步分析植物ACS基因的序列特征及分离全长cDNA提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料:非洲菊(Gerbera jamesonii Bolus)品种为金太阳，月季(Rosa chinensis)品种为云粉，均由云南省农业科学院惠赠;桂花(Osmanthus fragrans)、茶梅(Camellia sasanqua)和山茶(Camellia japonica)种植在西南林业大学树木园.本试验均采用相应植物盛开花朵的花瓣为研究材料.

主要试剂:RN09试剂盒购于北京艾德莱生物科技有限公司，TranZol UP试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司，Quant cDNA第一链合成试剂盒购于北京天根生化科技有限公司;DNA聚合酶、dNTPs、回收试剂盒和AT克隆试剂盒(克隆载体pMD18-T)等分子生物学常规试剂购于昆明宝生物工程有限公司.

1.2 方法

1.2.1 植物RNA的提取 用RN09试剂盒分别提取茶梅和山茶花瓣的RNA，其他材料花瓣的RNA均用TranZol UP试剂盒提取，提取步骤均按照相应的说明书进行.RNA提取后用DEPC处理过的1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，并用超微量分光光度计测定RNA的浓度.RNA的浓度稀释成500 ng·μL－1，用于后续的反转录操作.

1.2.2 简并引物的设计 用多序列比较软件［18］分析已在GenBank注册的龙眼、苹果和茶树等二十余种双子叶木本植物的ACS基因序列，找出相对保守的序列，结合Primer Permier 5.0引物设计软件，以尽量降低简并度为原则，设计ACS基因简并引物ACS-JBF(5'-TTATYCAAATGGGWCTYG-3')和ACS-JBR(5'-CWARACCRAAACTTGACA-3').预期片段长度为800 bp左右.

1.2.3 基因片段的克隆及测序 反转录使用Quant cDNA第一链合成试剂盒，按照说明书步骤进行操作，得到所需要的cDNA模板.分别以上述合成的cDNA作为模板，用“1.2.2”设计的简并引物进行PCR扩增.PCR运行程序为:95℃ 3 min;94℃ 45 s，53℃ 45 s，72℃ 60 s，运行32个循环;72℃充分延伸10 min;4℃暂存.将PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，回收亮带，克隆到pMD18-T载体上，由北京华大中生科技发展有限公司测序.

1.2.4 序列分析 将克隆得到的基因片段在 NCBI上进行BlastX(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)比对，然后用多序列比较软件［18］将所得到的序列进行多序列比对分析.

2 结果与分析

2.1 RNA的提取质量

非洲菊、月季、桂花、茶梅和山茶等5种植物花瓣的总RNA经电泳检测，均可见28S、18S和5S 3条清晰的电泳条带，其D260nm/D280nm为1.9－2.0，表明总RNA质量较高.

图1 用简并引物分别克隆5种植物花瓣的ACS基因片段Fig.1 Amplification of ACS gene in 5 plants with degenerate prmier

2.2 ACS基因片段的克隆

以5种植物的反转录产物cDNA为PCR模板，进行PCR扩增，结果发现均能得到扩增产物(图1)，且产物长度均为预期的800 bp左右.经测序，非洲菊、月季、桂花、茶梅和山茶的长度分别为786、786、786、824 和 821 bp，表明本试验所设计的ACS简并引物适用于5种植物花瓣.登录GenBank发现这几个序列均为本试验首次克隆的基因片段，将它们提交到GenBank，非洲菊、月季、桂花、茶梅和山茶的序列号分别为 JX503063、JX503064、JX503062、JX503065 和JX503066.

测序结果表明:左引物的第一个简并碱基(Y)只有桂花为C，其他为T;第二个简并碱基(W)只有月季为A，其他为T;第三个简并碱基(Y)只有非洲菊和茶梅为C，其他为T.右引物的第一个简并碱基(W)只有月季为A，其他为T;第二个简并碱基(R)只有茶梅为G，其他为A;第三个简并碱基(R)只有月季为A，其他为G.其中，非洲菊和茶梅的左引物完全相同，桂花、非洲菊和山茶的右引物完全相同.

2.3 序列分析

将本试验所克隆的基因片段在NCBI上进行Blast比对，发现非洲菊和月季的ACS基因与莴苣(Lactuca sativa)ACS基因(基因登录号:AF380836)的同源性最高，分别达86%和87%;桂花ACS基因与野生烟草(Nicotiana attenuate)ACS基因(基因登录号:AAR99393)的同源性最高，达80%;茶梅和山茶的ACS基因与茶树(Camellia sinensis)ACS基因(基因登录号:ABM88785)的同源性最高，均达94%.由此可以推断，所克隆的5个基因均为相应植物ACS基因的片段，且与植物ACS基因有较高的同源性.此外，通过序列比对还发现，5个ACS基因的片段中均包含一个天冬氨酸转氨酶结构域保守区段(图2).

图2 在NCBI上用Blast检索的结构域保守区段示意图Fig.2 Diagram of conserved domain by NCBI Blast

将5个ACS基因的cDNA片段在多序列比较分析软件上进行比对.结果(图3)表明:茶梅ACS基因与山茶ACS基因的cDNA序列差异最小，序列相似性达99%;非洲菊ACS基因与月季ACS基因的cDNA片段的相似性最高，为82%;月季ACS基因与山茶ACS基因的cDNA片段的相似性最低，为73%.将5个ACS基因相应的氨基酸序列进行比对，发现结果与上述cDNA片段比对结果相似(图4)，由于密码子简并性的关系，序列的相似性更高.

图3 5个ACS基因的cDNA片段的多序列比较Fig.3 Multiple sequence alignments of 5 ACS genes

图4 5个ACS氨基酸片段的多序列比较Fig.4 Multiple sequence alignments of 5 ACS amino acid

此外，通过序列比对发现，大部分已在GenBank提交的植物ACS基因全长为1200－1500 bp，且所克隆的5个基因片段更靠近基因的5'端，因此后续可通过5'-RACE往基因上游扩增约500 bp，通过3'-RACE往基因下游扩增约1000 bp，进而通过序列拼接即可得到全长cDNA序列.

3 讨论

3.1 提取高质量的RNA是进行基因克隆的关键

本试验在提取植物花瓣RNA时，最开始使用常规的RNA法［19－20］，虽然几经改进或优化提取方法，结果无RNA产物，或者RNA降解严重，或者RNA产量很低，均不适于后续的反转录试验.而使用试剂盒后也并非所有材料的RNA都可以用同一种试剂盒提取，如山茶和茶梅花瓣的RNA用北京全式金生物技术有限公司的TranZol UP试剂盒就无法提取.提取高质量的RNA是进行基因克隆的第一步，笔者进行了一段时间不同植物材料和不同组织器官的RNA提取试验后，建议在进行基因克隆时，可以首选RNA试剂盒进行试验，且要研究该试剂盒是否针对植物中多糖和多酚等问题，这样不仅可以节省大量时间，而且随着各个生物公司各种RNA产品的开发，试剂盒的成本已经大大降低，因此，使用RNA试剂盒是提高试验效率的捷径.

3.2 简并引物的设计

本试验所设计的一对简并引物是经过多次调整的，之前所设计的简并引物只能在某一两种植物中使用，或者根本无法使用.基于本试验，发现应该选择GenBank中双子叶植物的ACS基因进行引物设计.另外，由于ACS基因属多基因家族编码［3］，因此，所选择的ACS基因首先一定要进行序列比对，将序列相似性比较低的予以剔除.最后，将所选取的双子叶植物ACS基因进行序列分析，为了保证所克隆基因的准确性，以尽量降低简并度为原则，进行引物设计.

本试验设计的简并引物的简并度均为8，简并度较低，利用此对引物成功克隆了随机选择的非洲菊、月季、桂花、茶梅和山茶等5种植物花瓣的ACS基因，已经提交到GenBank并获得了序列号，这5种植物分别属于木犀科、菊科、蔷薇科和山茶科，此外，该对简并引物还成功克隆了诺丽、梅花和迎春花等植物花瓣的ACS基因(数据未在本文公布).因此，推论该对简并引物有较强的通用性，可以尝试在其他科属的植物中进行ACS基因的克隆，以便快速得到更多的ACS基因，并进一步分析该基因的保守性.然而，该对简并引物在玉兰中进行PCR扩增并未得到ACS基因，而是得到类似的细胞色素b-c1基因，因此，使用简并引物克隆的基因在测序后需认真进行序列比对分析，以进一步确证.该对简并引物在高盆樱、垂丝海棠和杜鹃等植物中进行了克隆，并未得到PCR产物，因此在后续的工作中，还应适当调整引物的简并度，以得到高通用性的ACS简并引物.

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