李世通，肖顺，章淑玲，周 峡，张绍升

(福建农林大学植物保护学院，福建福州350002)

腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor Thorne)是农作物上重要的病原线虫，主要为害马铃薯块茎和甘薯块根.在我国，腐烂茎线虫主要引起甘薯糠心病，一般可导致其减产20%－50%，重者则达80%以上，甚至绝收，在储藏期还可引起烂窖［1－2］.研究表明，腐烂茎线虫可与尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)在甘薯上形成显著的复合侵染;茄病镰孢(F.solani)也可以通过茎线虫造成的伤口侵染，加重甘薯病害的发生［3］.研究腐烂茎线虫的生物学特性、致病机理、遗传特点及防治技术等都需要大量的线虫群体，因此，掌握能够大量培养腐烂茎线虫的方法是非常必要的.用真菌培养腐烂茎线虫操作简单，培养量大，是目前常用的培养方法.已报道的可培养茎线虫的真菌有链格孢菌(Alternaria spp.)、镰刀菌(Fusarium spp.)、弯孢霉菌(Curvularia spp.)、葡萄孢菌(Botrytis spp.)、丝核菌(Rhizoctonia spp.)等［4］.本试验采用长柄链格孢(A.longipes)和茄病镰刀菌培养腐烂茎线虫，旨在筛选出适合培养腐烂茎线虫的真菌.

1 材料与方法

1.1 材料

2011年9月，从河北省迁安市甘薯田中采集感染糠心病的薯块和根际土壤.长柄链格孢和茄病镰刀菌均由本实验室保存.

1.2 方法

1.2.1 线虫的分离 将采集到的薯块冲洗干净，切成小块，然后采用改良贝曼漏斗法［4］分离，收集得到茎线虫，并在显微镜下剔除其他线虫.

1.2.2 真菌的培养 用18 mm×150 mm的试管制作PDA斜面(约10 mL)，在PDA斜面上分别接种长柄链格孢和茄病镰刀菌，在26℃的恒温箱中培养，至菌丝长满斜面.

1.2.3 线虫的消毒与培养 取灭菌的玻片，分别滴上1滴无菌水和1滴0.1%氯霉素溶液.挑取分离纯化的线虫20条，在无菌水中清洗1次，然后挑入0.1%氯霉素溶液中，再用移液枪将含有线虫的氯霉素溶液移入PDA斜面的菌丝上.每种真菌做6个重复.将斜面放入27℃恒温箱中培养60 d.

1.2.4 线虫的计数与统计分析 培养60 d后，将试管中的线虫用无菌水冲洗到灭菌的50 mL离心管中，离心并吸掉上清液，定容至7 mL，充分震荡使线虫在水中分布均匀.用20 μL移液枪分别吸取10滴线虫混合液，滴至载玻片上，在倒置显微镜下计数，并估算出线虫总数.用SPSS软件进行数据处理.

2 结果与分析

在27℃黑暗条件下，2种真菌培养腐烂茎线虫表现出一定的差异.从外观上看，长柄链格孢的菌丝浓密，在接种线虫后菌丝变得湿润(图1A)，这是被线虫取食的典型现象;在倒置显微镜下观察，线虫在试管壁聚集成密集的线虫网群(图1C).茄病镰刀菌的菌丝较稀薄，也有被线虫取食的典型现象(图1B);在倒置显微镜下观察，线虫数量比较少，试管壁上聚集成的线虫网较稀薄(图1D).

图1 2种真菌培养腐烂茎线虫的外观差异Fig.1 Appearance differences of D.destructor cultured by two fungi

统计结果(表1)表明:在27℃黑暗条件下培养60 d，在长柄链格孢上的最大培养量为35000条·管－1，最小为21000条·管－1，平均26800条·管－1;在茄病镰刀菌上的最大培养量为6230条·管－1，最小为3360 条·管－1，平均4853 条·管－1.

表1 2种真菌培养腐烂茎线虫的数量Table 1 Number of D.destructor cultured by two fungi

3 讨论

Young et al［5］在1995年培养了从人参根上分离到的腐烂茎线虫，确定最佳培养温度为20℃.但我国的报道指出，该线虫的最佳生长繁殖温度为27－28℃［2，4］.这可能是由线虫种群的差异所导致.本试验选用27℃培养线虫.

用真菌培养茎线虫的报道很多.Young et al［5］、徐进军等［6］报道了茄病镰刀菌是比较好的培养材料;刘斌等［7］报道在三角瓶中用玉米培养基培养的灰葡萄孢菌对该线虫的培养效果很好;林茂松［8］报道用毛壳菌可以培养腐烂茎线虫.在本试验中发现利用长柄链格孢培养腐烂茎线虫效果很好，适合该线虫的大量培养.该真菌具有两大优点:(1)易于培养，生长迅速，采用多点接种，3 d即可长满整个斜面;(2)菌丝浓密，适宜大量线虫的繁殖.

在接种方面，采用无菌水清洗1次后，连同线虫消毒液一起滴在菌丝上.这样既简化了操作步骤，又能防止细菌的污染，且对线虫和真菌的影响不大.

［1］刘维志.植物线虫志［M］.北京:中国农业出版社，2004:69－71.

［2］段玉玺.植物线虫学［M］.北京:科学出版社，2011:172－175.

［3］章淑玲，张绍升.甘薯茎线虫与镰孢菌对甘薯的复合侵染［J］.福建农林大学学报:自然科学版，2007，36(4):361－364.

［4］张绍升.植物线虫病害诊断与治理［M］.福州:福建省科学技术出版社，1999:73－156.

［5］YOUNG H K，SEUNG H O.In vitro culture and factors affecting population changes of Ditylenchus destructor of ginseng［J］.Korean Journal of Plant Pathology，1995，11(1):39－46.

［6］徐进军，李世东，杨之为.马铃薯茎线虫的培养［J］.西北农业学报，2004，13(4):77－80.

［7］刘斌，郑经武.腐烂茎线虫单异活体繁殖方法研究［J］.浙江农业学报，2006，18(6):445－447.

［8］林茂松.室内人工接种测定甘薯品种对马铃薯腐烂线虫的抗性［J］.南京农业大学学报，1989，12(3):44－47.