李 娜， 张玉婷， 刘 磊， 邵 辉， 李 辉， 李 晶， 郭永泽

（天津市农业质量标准与检测技术研究所，天津300381）

近几年，随着食品安全问题日益被重视，食品检验机构面临大量的检测工作。实现多类兽药同时检测是许多兽药残留分析工作者努力的目标。金刚烷胺是禁用药物，磺胺类、喹诺酮类、四环素类兽药是兽医临床上常用且容易被滥用的药物，农业部对上述兽药也制定了最大残留限量（MRLs）标准。因此，建立兽药多残留快速检测方法非常有必要。

液相色谱-串联质谱法因具有高灵敏度和高选择性的优势，已成为复杂的动物组织样品中多类兽药残留同时检测的主流方法［1-7］。这些方法有的同时检测受体激动剂、喹诺酮和磺胺类兽药［1］，有的同时检测四环素类与喹诺酮类兽药［2］，有的同时检测β-内酰胺、大环内酯、磺胺类和氟喹诺酮类［3-6］。但是，四环素类兽药理化性质特殊，较难与其他多类兽药同时提取、净化，因此，文献报道也较少［7-10］。

QuEChERS 方法快速、简便、成本低廉、易于操作，已逐步被应用于多类兽药残留检测［8-16］。本研究采用改进的QuEChERS 方法提取、净化样品，解决了四环素类兽药难与其他兽药同时检测的难题，结合超高效液相色谱-串联质谱仪检测，建立了动物源食品中四环素类、磺胺类、喹诺酮类和金刚烷胺4类29 种禁限用兽药的同时快速检测方法。与国标方法［17，18］和文献报道方法［7-10］相比，本研究所建方法操作更简单、快速，检测成本更低，适用于各食品检测机构对鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝样品中禁限用兽药残留的日常监控。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AcquityTMUPLC 超高效液相色谱仪，Quattro Premier XE 三重四极杆质谱仪（配电喷雾离子源）（美国Waters 公司）；QL-901 旋涡混合器（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；H1650 台式高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；Laborota 4000 efficient 旋转蒸发仪（德国Heidolph）；Milli-Q 超纯水仪（美国Millipore 公司）。

29 种兽药包括磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、金刚烷胺、磺胺甲基嘧啶、麻保沙星、磺胺二甲基嘧啶、四环素、氧氟沙星、土霉素、诺氟沙星、单诺沙星、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噻二唑、环丙沙星、恩诺沙星、金霉素、二氟沙星、沙拉沙星、磺胺氯哒嗪、磺胺甲恶唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺异恶唑、强力霉素、恶喹酸、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉和氟甲喹，标准品纯度均不低于99%，购自德国Dr. Ehrenstorfer 公司；乙腈、甲酸为色谱纯，购自美国Fisher 公司；氯化钠为分析纯，购自天津科密欧化学试剂有限公司；水为超纯水。吸附剂HLB 购自北京市广普达科技有限公司，吸附剂C18、PSA、NH2购自上海安谱科学仪器有限公司。

分别称取各标准品适量，磺胺类兽药用乙腈溶解并定容，四环素类兽药用甲醇溶解并定容，金刚烷胺用1% 甲酸乙腈溶解并定容，喹诺酮类兽药用0.03 mol／L 氢氧化钠溶液溶解，甲醇定容，配制成质量浓度均为100 mg／L 的标准储备液，于4 ℃条件下保存。分别吸取29 种兽药标准储备液0.25 mL 于25 mL 容量瓶，用乙腈稀释并定容，配制成质量浓度为1.0 mg／L 的混合标准工作液Ⅰ；吸取金刚烷胺标准储备液0.1 mL，分别吸取四环素类兽药标准储备液各0.5 mL，分别吸取磺胺类和喹诺酮类兽药标准储备液各1 mL，于100 mL 容量瓶，用乙腈稀释并定容，配制混合标准工作液Ⅱ，其中金刚烷胺质量浓度为0.1 mg／L，四环素类兽药质量浓度为0.5 mg／L，其他兽药质量浓度为1.0 mg／L。于4 ℃条件下保存，可使用一个月。

0.1 mol／L Na2EDTA-McIlvaine 缓冲溶液（pH值4.0）的配制:准确称取12.9 g 柠檬酸（C6H8O7·H2O）、10.9 g 磷酸氢二钠（Na2HPO3·12H2O）、37.2 g Na2EDTA·2H2O，加超纯水900 mL 溶解，用1 mol／L NaOH 调pH 值至4.0，加超纯水稀释至1 000 mL。

1.2 样品前处理方法

准确称取试样2.00 g（精确至0.01 g）于50 mL聚丙烯塑料离心管中，加入2 mL 0.1 mol／L Na2EDTA-McIlvaine 缓冲溶液和3 mL 乙腈，于旋涡混合器上涡旋2 min，4 000 r／min 离心5 min，收集上清液于另一个50 mL 离心管中；残渣中加入5 mL 乙腈，于旋涡混合器上涡旋2 min，4 000 r／min离心5 min；合并上清液于上述50 mL 离心管中。于上清液中依次加入200 μL 乙酸、1 g 氯化钠，于旋涡混合器上涡旋1 min，4 000 r／min 离心5 min，取乙腈相（上层）2 mL 于10 mL 聚丙烯塑料离心管中，加入C18 和NH2吸附剂各100 mg，涡旋1 min，4 000 r／min 离心5 min，取上清液，氮气吹干。残渣中加入1 mL 甲醇-0.1% 甲酸水（10∶90，v／v）定容，过0.22 μm 有机滤膜。

1.3 色谱条件

色谱柱:AcquityTMBEH RP18 柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流动相:A 相，0.1% （v／v，下同）甲酸甲醇；B 相:0.1% 甲酸水；梯度洗脱程序:0～3 min，5% A ～20% A；3 ～7 min，20% A ～40%A；7 ～10 min，40% A；10 ～11 min，40% A ～90%A；11 ～12 min，90% A；12.1 min，5% A；12.1 ～14 min，5% A。进样量:10 μL；柱温:30 ℃。

1.4 质谱条件

电离模式:电喷雾正离子（ESI （＋））；毛细管电压:3.0 kV；离子源温度:110 ℃；脱溶剂气温度:380 ℃；脱溶剂气流量:550 L／h；锥孔反吹气流量:50 L／h；检测方式:多反应监测扫描模式（MRM）；质谱采集参数见表1。

表1 29 种兽药的保留时间、质谱检测条件、基质匹配线性方程、相关系数（r）、检出限和定量限Table 1 Retention times，mass spectrometric conditions，matrix-matched linear equations，correlation coefficients （r），LODs and LOQs for the twenty-nine veterinary drugs

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 质谱条件

在电喷雾正离子模式下分别对1 mg／L 的单个标准溶液进行全扫描，得到每种兽药的分子离子，然后对分子离子进行二级质谱全扫描，选择信号强度较大的两个碎片离子为特征子离子，并优化得到每种兽药的母离子和子离子所需的最佳锥孔电压和碰撞能量，最后以多反应监测模式进行扫描。优化得到的质谱参数见表1。

2.1.2 梯度洗脱条件的优化

本研究分别以乙腈-0.1% 甲酸水和甲醇-0.1%甲酸水作为流动相，比较二者的分离效果。结果表明，甲醇-0.1% 甲酸水作为流动相时，29 种兽药的分离效果更好。

甲醇与0.1% 甲酸甲醇的比较:由于采用梯度洗脱，本研究尝试在流动相甲醇中也加入0.1% 甲酸，以确认是否有助于化合物的电离。结果表明，加入甲酸后兽药的响应信号果然更强，重复性更好。因此，本研究最终采用0.1% 甲酸甲醇-0.1% 甲酸水作为流动相。

梯度洗脱条件的优化:经过反复试验，改变不同时间段流动相中有机相与水相的比例，最终确定了最佳梯度洗脱条件，获得了29 种兽药的最佳分离效果，29 种兽药的总离子流色谱图见图1。

图1 29 种兽药的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatograms of the 29 veterinary drugs

2.2 定容溶液的选择

用UPLC-MS／MS 检测时，目标物的色谱峰形、分离度及响应值受定容溶液的影响较大。

根据经验，本研究对以下5 种定容溶液进行比较。（1）比较甲醇-水（10∶90，v／v）和甲醇-0.1% 甲酸（10∶90，v／v）的溶解效果。结果表明:0.1% 甲酸作为水相溶解效果更好，色谱分离度更好，响应信号更高，色谱峰对称，尖锐。（2）乙腈和甲醇的比较:比较乙腈-0.1% 甲酸（10∶90，v／v）和甲醇-0.1% 甲酸（10∶90，v／v／v）的溶解效果。结果表明，二者无明显差异，分离效果都很好，所得色谱峰尖锐、对称。（3）甲醇-0.1% 甲酸不同比例的比较:根据经验，选取10∶90、20∶80 和50∶50（v／v）3 种比例进行比较。结果表明，比例为10∶90 时效果最好，比例为50∶50时效果最差。甲醇的比例越高，色谱峰前延现象越明显，分离度也越差，这种影响在磺胺醋酰和磺胺嘧啶两种化合物上体现得最明显。因此，鉴于流动相使用甲醇，本研究最终采用甲醇-0.1% 甲酸水（10∶90，v／v）作为定容溶液。

2.3 样品前处理条件的优化

2.3.1 提取溶剂的选择

提取溶剂的选择是本研究的难点。四环素类兽药很难与磺胺类、喹诺酮类兽药同时提取。参照文献，本研究先后采用乙腈［1，6，8］、5% 醋酸乙腈［4，14-16］、0.1 mol／L Na2EDTA-McIlvaine 缓冲液［2，16］、5% 三氯乙酸［5］和0.1 mol／L Na2EDTA-McIlvaine 缓冲液-乙腈混合溶液［7］5 种溶液进行提取。结果表明，乙腈提取时金刚烷胺、喹诺酮类和四环素兽药的回收率都较低；5% 醋酸乙腈提取时四环素类兽药回收率仅20% ～30%；0.1 mol／L Na2EDTA-McIlvaine缓冲液可以很好地提取四环素类和喹诺酮类兽药，但磺胺类的回收率仅50% 左右；0.1 mol／L Na2EDTA-McIlvaine 缓冲液-乙腈混合溶液提取时，4 类兽药的回收率都能够满足要求；5% 三氯乙酸提取，沉淀蛋白的同时，也能很好地提取4 类兽药。因此，最终选择0.1 mol／L Na2EDTA-McIlvaine 缓冲液-乙腈或者5% 三氯乙酸作为提取液。

经过反复试验摸索，本研究最终确定称样2.00 g 时，加0.1 mol／L Na2EDTA-McIlvaine 缓冲液的体积以2 mL 为宜，提取两次，第一次用2 mL McIlvaine 缓冲液和3 mL 乙腈提取，第二次用5 mL 乙腈提取。

2.3.2 净化方法的确定

本研究设计了两种试验方案。方案一:采用0.1 mol／L Na2EDTA-McIlvaine 缓 冲 溶 液-乙 腈 提取，盐析，取2 mL 乙腈相，C18、PSA 或NH2分散固相萃取净化（吸附杂质），上清液氮气吹干，1 mL 甲醇-0.1% 甲酸（10∶90，v／v）定容。方案二:采用5%三氯乙酸提取，取2 mL 提取液，HLB 分散固相萃取净化（吸附目标兽药），用甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，1 mL 甲醇-0.1% 甲酸（10∶90，v／v）定容。结果表明:方案一的净化效果好，4 类兽药的回收率结果都能满足要求。方案二净化效果虽好，但4 类兽药的回收率均小于60%。因此，选择方案一的方法净化。

吸附剂的选择及用量:比较了C18、PSA 和NH23 种吸附剂的净化效果。结果表明，PSA 吸附磺胺类兽药，C18 和NH2协同净化效果较好。在2 mL提取液中分别加入C18 和NH2各50 mg、100 mg、150 mg 进行比较。结果显示，用量150 mg 时，少量兽药被吸附，用量100 mg 时比50 mg 净化效果好，且不会吸附兽药。因此，本研究确定C18 和NH2的用量为100 mg。

盐析前加乙酸调pH 值的必要性:加乙酸200 μL，调pH 值至3.5，目的是为了降低四环素类兽药在缓冲液中的溶解性，使其更易分配至乙腈相中，以提高回收率。

2.4 方法的线性关系、灵敏度、准确度和精密度

为了消除基质效应，本实验用基质匹配标准工作溶液绘制标准曲线。以各组分的质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，线性方程和相关系数见表1。29 种兽药在各自的质量浓度范围内，峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，相关系数为0.993 ～0.999。以信噪比为3 计算方法的检出限，以信噪比大于等于10 确定方法的定量限，29种兽药的检出限在0.3 ～3.0 μg／kg 之间。金刚烷胺的定量限为1.0 μg／kg，四环素、土霉素、金霉素和强力霉素的定量限均为10.0 μg／kg，其他兽药的定量限均为5.0 μg／kg。

在29 种兽药的LOQ 水平、20 μg／kg 和50 μg／kg 3 个水平做加标回收率试验，每个水平做5个平行样品。称取2 g 空白鸡肉、鸡肝、猪肉和猪肝样品，添加适量混合标准溶液，涡旋混合1 min，混匀后静置15 min，按照1.2 节所述的前处理方法进行提取、净化后，进行UPLC-MS／MS 测定。为了消除基质效应，用空白样品基质加标作为标准品。根据添加样品与标准品中各组分的峰面积计算回收率。29 种兽药在4 种组织中的平均回收率和相对标准偏差（RSD）均列于表2 中。由表2 可以看出，29 种兽药在鸡肉、鸡肝、猪肉和猪肝4 种动物组织中的平均回收率在71.5% 和93.2% 之间，相对标准偏差在0.8% 和7.7% 之间，符合多残留分析的要求。

表2 鸡肉、鸡肝、猪肉和猪肝样品中29 种兽药的加标回收率及RSD（n ＝5）Table 2 Average recoveries and the RSDs of the 29 veterinary drugs in chicken muscle，chicken liver，porcine muscle，and porcine liver samples （n ＝5）

表2 （续）Table 2 （Continued）

表2 （续）Table 2 （Continued）

2.5 实际样品的测定

从天津市各超市和农贸市场购买8 份鸡肉、3份鸡肝、5 份猪肉和4 份猪肝样品，采用本研究建立的多残留方法进行测定。检测结果显示，1 份鸡肉样品检出磺胺醋酰和磺胺嘧啶，残留量分别为10.6 μg／kg 和13.5 μg／kg，1 份鸡肝样品检出恩诺沙星，残留量为24.7 μg／kg。其他样品中均无兽药检出。

3 结论

本研究解决了四环素类药物难与其他多类兽药同时提取、净化的难题，建立了动物源食品中四环素类、磺胺类、喹诺酮类和金刚烷胺4 类共29 种兽药的QuEChERS-UPLC-MS／MS 快速检测方法。分别对液相色谱条件、质谱条件、提取溶剂、净化方法、吸附剂的选择及用量等样品前处理条件进行了优化研究，采用改进的QuEChERS 方法处理样品，发挥了其快速、简便的优势，与国标方法和现有文献方法相比，该方法大大缩短了检测周期，节约了检测成本。本研究方法操作简便、快速、净化效果好，灵敏度、准确度和精密度均符合多残留检测技术的要求，为各食品检测机构提供了简单快速的筛选方法，有助于食品检测机构应对大批量的鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝样品中禁限用兽药的日常监控。

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