马永，郭伟鹏，周锦祯，林秀华，吴清平

（1.福建生物工程职业技术学院食品与生物工程系，福建福州350700；2.省部共建华南应用微生物国家重点实验室，广东广州510070；3.广东省微生物研究所，广东广州510070；4.广东省微生物分析检测中心，广东广州510070）

柠檬酸复合消毒剂，由有机氯、柠檬酸、硫酸钠等成份混合组成，使用时根据不同需求，用水溶解并稀释至需要的浓度即可.对口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪水泡病毒、鸡新城疫病毒、鸡法氏囊病毒、大肠杆菌、葡萄球菌等病原微生物均具有显著的杀灭作用.具有杀菌效果可靠、稳定性好，腐蚀性小，使用安全、环保[1]等特点，而且产品刺激性气味小.柠檬酸消毒剂与80℃温度联合用于透析机管路消毒取得很好的效果[2]，目前国内医院血透机所用的消毒剂基本上是国外品牌的柠檬酸消毒剂（如费森柠檬酸消毒剂、贝朗柠檬酸消毒剂等），国内研发出来的柠檬酸消毒剂与进口产品相比价格优势明显，但是消毒效果是否与其一样，令人质疑.为了了解其杀菌效果，本研究以国外品牌的柠檬酸消毒剂（费森、贝朗）做为对照，按照《消毒技术规范》（卫生部2002 版）杀菌性能测试的要求进行实验室杀菌试验，以评估国产柠檬酸杀菌效果.

细菌芽胞是有些细菌（多为杆菌）在一定条件下细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体，是整个生物界中抗逆性最强的生命体[3]，是否能消灭芽孢是衡量各种消毒灭菌手段的最重要的指标.选择细菌芽胞来评价进口和国产柠檬酸消毒剂的杀菌效果具有很重要的意义.

1 材料与方法

1.1 材料[4]

1）菌悬液和菌片的制备.取枯草芽胞杆菌（Ba⁃cillus subtilis ATCC9372）代数为第4-6代；

2）营养琼脂培养基：广东环凯微生物科技有限公司；

3）标准硬水：CaCl2：3.04g/100mL，MgCl2，1.39g/100 mL，用来配置待检消毒剂；

4）PBS：0.03 mol/L磷酸盐缓冲液；

5）中和剂：0.5 g/100mL 硫代硫酸钠、1g/100mL吐温80的PBS溶液；

6）刻度试管：1.0、5.0、10.0mL等；

7）载体：将医用止血钳截断，取其由轴至齿端部分，按照《消毒技术规范》（卫生部2002版）规定方法进行脱脂处理.

8）消毒剂溶液的配制：用无菌标准硬水稀释制得25%和50%国产环凯牌柠檬酸消毒剂、费森柠檬酸消毒剂（25%）、贝朗柠檬酸消毒剂（50%）.

1.2 方法

1）芽胞悬液.取B.subtilis（ATCC 9372）液体培养物3 mL，接种于罗氏瓶中营养肉汤培养基表面，置于37 ℃恒温培养箱内，培养8 d.用接种环取菌样少许，采用孔雀绿法进行芽胞染色，并在显微镜下进行镜检.当芽胞形成率达95%以上时，即可进行芽孢悬液的制备.用无菌水30 mL轻轻推刮下菌苔，集中于一含玻璃珠的无菌三角瓶中，振摇30min，分散培养物，制成均匀的悬液.将盛装上述悬液的三角瓶置于45 ℃水浴中24 h，分散成单个芽胞.最后，将三角瓶放于80 ℃水浴中10 min，以杀灭残余的细菌繁殖体，待冷至室温后，即为芽胞悬液[5].将芽孢悬液与含3g/100 mL 小牛血清白蛋白溶液以等体积混合制成1×108～5×108 cfu/mL菌悬液，备用.

2）医用染菌止血钳的制备.模拟现场试验用医用止血钳样本：取医用止血钳由轴至齿端部分，进行脱脂处理，经压力蒸汽灭菌后，烤干备用[4].

用无菌镊子将止血钳样本齿面朝上，并固定在无菌支撑物上.用0.1mL定量无菌移液器，将0.02mL菌悬液（含量为2.5×107～2.5×108cfu/mL）滴染于齿部，用无菌L型铂金丝涂匀，置37℃恒温箱内干燥备用[6]，菌片含菌量为5×105cfu/mL～5×106cfu/片.

3）中和剂鉴定试验.设平行6 组试验，按《消毒技术规范》（卫生部2002版）中规定的中和剂鉴定试验程序进行[6].

4）悬液定量杀灭试验.在80 ℃水浴条件下，吸取以上制备好芽胞菌悬液0.5 mL加入到4.5 mL消毒液试管内（阳性对照为PBS）混匀.作用至规定时间，吸取0.5 mL 加于4.5 mL 中和剂试管中混匀，中和作用10 min.经充分混合均匀，取样进行活菌培养计数，计算杀灭对数值.试验重复3次[4].

5）医疗器械的消毒模拟现场试验.将30个医用止血钳染菌样本浸没于10 mL已在80 ℃水浴中保温5 min 的消毒液中进行消毒处理.作用至规定时间，取出样本,分别移入含10 mL 中和剂溶液的试管内.经充分混合均匀，取样进行活菌培养计数[5]，以无菌蒸馏水代替消毒液，将两个染菌载体依上同样条件处理，然后与试验组载体同法接种、培养、观察结果，作为阳性对照组.

以上试验结束后，将用过的同批次中和剂、采样液、稀释液接种培养基，进行培养；另将未用过的同批培养基亦放入恒温箱内培养，作为阴性对照[4].

2 结果与分析

2.1 中和剂鉴定试验试验

经检测，所采用的中和剂，可有效中和柠檬酸消毒剂对试验菌的残留作用，且该中和剂及其中和产物对试验菌生长无不良影响，组间菌落数误差小于15%，符合中和剂的要求（见表1）.

表1 消毒剂中和剂试验Tab.1 The result of neutralizer test of the disinfectant

2.2 悬液定量杀菌结果

通过3 次试验结果，三种柠檬酸消毒剂在测试时间15 min、试验温度80 ℃均可以将菌全部杀死，达到100%杀菌率，杀菌效果基本一致，结果见表2.

2.3 医疗器械的消毒模拟现场试验结果

通过30 次试验三种柠檬酸消毒剂在测试时间15min、试验温度80 ℃医疗器械消毒模拟现场试验时，三种柠檬酸消毒剂均具有杀菌作用，符合要求，见表3.

表2 柠檬酸消毒剂悬液定量杀菌试验结果Tab.2 The killing results of suspension quantitative germicidal of citric acid disinfectant

表3 柠檬酸消毒剂模拟现场杀菌试验结果Tab.3 The killing results of simulated on-the-spot test of citric acid disinfectant

3 讨论

血液透析机用于急慢性肾功能衰竭患者肾脏替代治疗.将体内血液引流至体外，经透析器清除代谢废物、维持病人体内的电解质和酸碱平衡；同时清除病人体内过多的水分.它的消毒效果与病人的生命息息相关，目前血液透析机多采用进口的柠檬酸消毒剂.

柠檬酸是柠檬酸消毒剂中的主要有效成份.柠檬酸水溶液在温度大于80 ℃时其pH小于3，属于强酸.细菌的生存都需要一个特定的pH，柠檬酸的酸性可改变细胞内的pH 值，影响到细菌的正常代谢.显酸性的高浓度氢离子也会改变细菌的生物活性，直接伤害到菌体细胞，从而引起细菌的死亡，而热力也是促进柠檬酸杀芽孢效果的一个重要因素.所以在常温下柠檬酸并没有杀芽孢效果，当温度加热至大于80 ℃时，微生物受到热力的作用，细胞活动加速，其芽孢外壳的通透性也会改变.同时在热力的作用下，柠檬酸溶液的分子运动也会改变，其渗透性也会增强.所以在80 ℃及柠檬酸水溶液的共同作用下，柠檬酸消毒剂表现出优秀的杀芽孢效果[6].

通过上述试验，其结果表明国产和进口柠檬酸消毒效果没有区别，完全可以取代进口费森和贝朗柠檬酸消毒剂.实验结果需要我们进一步在血液透析机消毒实际工作中得到验证.

[1]林秋婵,吴清平,邓金花,等.比较两种方法测定柠檬酸与热力协同杀菌作用[J].中国消毒学杂志,2013,30(2):103-105.

[2]刘学军,陆文进,张凌.血液透析机消毒效果的临床观察[J].中华医院感染学杂志,2014,24(1):245-246;249.

[3]东秀珠,蔡妙英.常见细菌鉴定手册[M].北京:科学教育出版社,2001.

[4]卫生部卫生法制与监督司.消毒技术规范[M].北京:中国标准出版社,2002:83-93.

[5]李飞,陈羽.醋酸氯已定的杀菌效果[J].微生物杂志,2014,2(34)1:101-103.

[6]王晓,赖发伟,杨宁,等.柠檬酸与热力协同消毒作用相关性能试验研究[J].中国消毒学杂志,2013,30(1):6-8.