张翠云, 张 胜, 何 泽, 殷密英, 宁 卓

中国地质科学院水文地质环境地质研究所, 河北石家庄 050061

污染物的自然衰减存在于任何一个污染场地,是由于天然存在的物理、化学和生物作用, 污染物的浓度或总量不断地下降。不同污染场地, 自然衰减强度不尽相同, 取决于污染物性质和地下环境条件。自然衰减的有效性评价是污染场地修复方案选择的基础, 这种评价必须确定微生物作用是否能够以保护人类健康和环境的速率正在发生。微生物含量、分布、活性和多样性的调查有助于我们确定这种作用的潜力。

微生物广泛分布于地下环境, 包括包气带, 包气带通常是污染物进入地下水的通道, 包气带中的微生物能够降解或转化污染物为毒性较小的物质,从而减少污染物进入地下水的通量。在许多农业区,包气带厚度可达几十米。以往的大部分微生物研究主要集中在浅部土壤层或者是下部含水层(Klečka et al., 1990; Ludvigsen et al., 1999; Tate, 2000;Chapelle, 2001; Fierera et al., 2003; 张胜等, 2003;齐永强等, 2003), 很少研究地下水面以上的厚层包气带。

本文的研究目的是利用传统的培养技术和现代的磷脂脂肪酸(Phosphor Lipid Fatty Acid, PLFA)技术、Biolog技术、16 S rRNA基因变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)和测序技术, 调查石家庄市南部污灌区厚近30 m包气带微生物含量、分布、活性和多样性, 获得厚层包气带生物自然衰减评价所需的综合的微生物信息, 评价厚层包气带污染物自然衰减的微生物作用潜力。

1 场地概况

图1 取样点位置示意图Fig.1 Sketch map showing sampling sites

取样场地(N37˚58’34", E114˚31’46")位于石家庄市南部污灌区(图 1)。污水灌溉始于 1958年, 污水水源来自石家庄市排放未经处理的污水, 由城市生活污水和工业废水组成。污灌作物主要是冬小麦和夏玉米。污灌区主要分布在排污渠两侧0.5 km到2 km范围内。年降雨量480 mm, 集中在6—9月, 年蒸发量1972 mm。

所在地区属太行山东麓山前倾斜平原的南部,由滹沱河冲洪积扇南缘、槐沙河洪积冲积扇的北部及其扇间洼地所组成。基底为冀中拗陷, 自第四纪以来, 沉积了巨厚沉积物。地下水主要赋存在第四系松散沉积物中。由于周边超量开采地下水, 地下水位持续下降, 包气带厚度不断增加, 由20世纪60年代2～3 m, 增加到近年约30 m, 岩性主要是亚粘土, 砂和粘土。

2 样品采集与分析

2009年5月, 在污灌区麦地钻探采集厚层包气带剖面土样。取样深度1 m以上为5 cm、20 cm、50 cm和100 cm; 1～10 m取样间隔0.5 m, 10 m以下取样间隔 2 m, 终孔深度 28.8 m, 采集样品 27组,用于物理(含水量、粒度分析)、化学(溶解有机碳、NO3–、Cl–和 SO42–)、可培养微生物、PLFA、Biolog和16 S rRNA基因DGGE分析和测序。化学样品采样方法由上海澳实分析检测有限公司提供的采样瓶、采样说明、保温箱进行采样和保存。除了物理分析样品外, 其余样品均现场保温箱低温保存, 快速送回实验室后, PLFA分析样品–80℃冰箱保存,可培养微生物和Biolog分析样品4℃冰箱保存。

含水量测试采用称重法, 100～105℃, 烘干8 h。土样NO3–含量分析, 10 g湿土溶于50 mL去离子水中, 震荡15 min, 静置30 min, 6000 rps离心10 min,取上清液采用紫外分光光度法测试(Pansu et al.,2006)。土样中的 Cl–、SO42–和溶解有机碳 DOC(Dissolved Organic Carbon)由上海澳实分析检测有限公司分析, 颗粒分析由中国地质科学院水文地质环境地质研究所分析测试中心完成。

可培养微生物分析项目包括细菌总数TNB(total number of bacteria)、腐生厌氧菌总数SAB(saprophytic anaerobic bacteria)、亚硝化菌NB1(nitrosobacteria)、硝化菌 NB2(nitrobacteria)、反硝化菌DB(denitrifying bacteria)、铁氧化菌IOB(iron oxidizing bacteria)、硫酸盐还原菌 SRB(sulfate reducing bacteria)和产甲烷菌 MB(methanogenic bac-teria)等8项, 其中TNB和SAB采用平板计数法, 结果以每克干土菌落形成单位 CFU(colony-forming units)表示; 其余采用液体稀释法, 结果以每克干土最大或然数 MPN(most probable number)表示(陈绍铭等, 1985; 许光辉等, 1986; 中国科学院南京土壤研究所微生物室, 1985; 焦瑞身等, 1990; 鲁如坤,2000)。SAB在充有氮气的真空手套箱中室温(22～28℃)培养, 其余在生化培养箱中30℃培养。细菌培养时间: TNB 48 h, SAB 10 d, NB1和NB2 14 d, DB 14 d, IOB 10 d, SRB 21 d, MB 30 d。

土样总 DNA根据 Zhou等(1996)的方法提取,采用试剂盒Mobio Power Clean DNA clean-up kit进行DNA纯化。16 S rRNA基因扩增引物为通用引物F357GC (5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG -3’) 和 R518(5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)。PCR的反应条件为: 预变性条件为 94℃ 2 min, 前 20个循环为 94℃ 1 min,65～55℃ 50 s和72℃ 30 s (其中每个循环后复性温度下降 0.5℃), 后 10个循环为 94℃ 1 min, 55℃50 s 和 72℃ 30 s, 最后在 72℃下延伸 5 min。DGGE、PLFA、Biolog分析在中国科学院生态环境研究中心进行, DGGE条带切割纯化克隆后送北京华大基因公司测序。

3 结果

3.1 物理化学特征

颗粒大小、含水量、DOC、NO3–、SO42–和 Cl–在包气带剖面不同深度的含量分布如图2所示。剖面粉砂和砂的平均含量各为 42%左右, 粘土含量较低, 平均 14%。地层结构主要是亚粘土层, 夹少量砂层和粘土层, 4.5—5.5 m层段为一明显的砂层,12.5 m深处为一明显的重粘土层, 剖面底部为亚砂土质砂层, 其余主要为亚粘土层。含水量在浅部5 cm和20 cm处含量较高, 均为24%, 但在砂层含量很低, 为 5%, 接近地下水位处含量最高, 为29%。DOC在表层5 cm 和20 cm处含量较高, 分别为78 mg/kg和60 mg/kg, 而在下伏包气带含量很低, 变化在14～36 mg/kg之间, 但是在22 m深处出现一峰值, 为103 mg/kg, 取样时发现此层位有黑色的泥炭层。NO3–含量在浅表 5 cm 处较高, 为72.1 mg/kg, 其下含量随岩性而变化, 在砂层含量低, 变化在 13～23 mg/kg, 但是在重粘土层上方的亚粘土层出现一峰值, 为142.10 mg/kg。SO42–在浅表5 cm含量最高, 为226 mg/kg, 其下含量随岩性而变化, 在砂层含量低, 小于 29 mg/kg, 在粘土层出现峰值, 为 179 mg/kg; Cl–与 NO3–、SO42–分布不尽相同, 在浅表含量低, 5 cm 和 20 cm 处分别为59 mg/kg和 64 mg/kg, 但是其下也随岩性而变化,在砂层含量低, 为 16～41 mg/kg, 在粘土含量较高的 0.8 m和 12.5 m处分别出现峰值, 分别为108 mg/kg和109 mg/kg。

3.2 可培养微生物分布特征

利用可培养方法检测的TNB、SAB、NB1、NB2、DB、IOB、SRB和MB含量在厚层包气带沉积物中的分布如图3所示。

培养法获得的TNB变化在104～106CFU/g dw之间, SAB变化在102～107CFU/g dw之间, NB1含量变化于 0～106MPN/g dw之间, NB2含量变化于 0～106MPN/g dw 之间, DB 含量变化于 103～107MPN /g dw之间, IOB含量变化 于 0～106MPN /g dw 之 间, SRB 含 量 变化 于 0～102MPN /g dw 之 间, MB 含 量 变化于0～102MPN /g dw之间。

图2 厚层包气带不同深度沉积物物理和化学含量分布Fig.2 Distribution of concentrations of physical and chemical compositions from sediments of different depths in the thick vadose zone

图3 厚层包气带不同深度沉积物可培养微生物含量分布Fig.3 Distribution of content of cultivable bacteria from sediments of different depths in the thick vadose zone

TNB在厚层包气带剖面的分布特征是, 在浅表土壤层 5 cm至 50 cm层段含量很高, 达到n×106CFU/g dw; 在砂层段4.5～5.5 m含量最低, 为n×103～ n×105CFU /g dw; 在砂层下部亚粘土层, 含量又增加到n×105CFU/g dw, 但是在12.5 m重粘土层, 含量下降到n×104CFU/g dw; 在DOC含量增大的22 m处及其附近, 含量又增加到n×105CFU/g dw;到最下部亚砂土质砂层含量又降低到n×104CFU/g dw。SAB, 总体来说, 较细菌总数低1～2个数量级, 在 5 cm和 20 cm处含量较低, 为n×104～ n×105CFU/g dw, 但是在0.5 m和0.8 m处,出现峰值, 达到 n×106CFU/g dw, 在砂层含量也较低, 为n×103CFU/g dw; 在重粘土层及其以下层位含量更低, 大部分为n×102CFU/g dw。

NB1在浅表土壤层 5 cm处含量最高, 为1.7×106MPN/g dw, 其下至 10.5 m 层段大部分为n×103MPN/g dw, 再往下含量很低, 大部分<10 MPN/g dw。NB2在浅表土壤层5 cm和20 cm处含量较低, 为n×104MPN/g dw, 但是在0.5 m和0.8 m处, 出现峰值, 达到n×106MPN /g dw, 在1 m至7.5 m层段, 除了个别深度出现n×102MPN /g dw外, 大部分深度含量<60 MPN /g dw; 7.5 m以下层段含量大部分为0。

DB在整个剖面均有分布, 与TNB分布相似。在 5 cm 和 20 cm 处 含 量 较 高, 分 别 为1.4×106MPN/g dw 和 2.0×107MPN/g dw; 在砂层含量较低, 为n×103～ n×105MPN/g dw; 其下大部分为n×104MPN/g dw。IOB在浅表0.8 m以上含量较高,为n×104～ n×105MPN/g dw; 在 0.8 m至4 m层段,含 量 为 n×104MPN/g dw; 在 砂 层 为 0～n×103MPN/g dw; 其 下 大 部 分 为 n×102～n×103MPN/g dw。SRB在浅表5 cm处含量最大, 为3.1×102MPN/g dw, 其下大部分<10 MPN/g dw。浅表 5 cm和 20 cm处含有少量 MB, 分别为24.8 MPN/g dw和9.4 MPN/g dw, 其下大部分为0,但是在 22 m 处上下层位出现峰值, 均为1.3×102MPN/g dw, 峰值下含量也较高, 为29.7～58 MPN/g dw。

3.3 生物量和活性分布特征

磷脂脂肪酸PLFA (Phosphor Lipid Fatty Acid)是活体细胞膜的主要成分, 周转速率极快且随细胞死亡而迅速降解, 是生物标记物之一。PLFA含量越高, 生物量越高。厚层包气带剖面13个不同深度土样, 包括浅表土壤层、砂层和下部粘土层附近样品,进行了PLFA分析。结果显示, PLFA含量在浅表土壤层5 cm处最高, 为51.359 nmole/g dw, 在砂层含量极低, 为0.249 nmole/g dw, 在下伏高DOC含量层位附近PLFA含量又增加(图4A)。 据估计, 1 nmol PLFA 相当于 2.0×107个细菌(Balkwill et al., 1988)。厚层包气带剖面 PLFA含量变化在 0.249～51.359 nmol/g dw之间, 据此估计的细菌数为5.0×106～1.0×109cells/g dw, 该值较平板计数获得的TNB高3个数量级。此外, 代表厌氧菌的PLFA生物标记cy17:0和cy19:0仅在土壤层50 cm以浅有分布, 前者在 5 cm、20 cm和 50 cm处分别为 1.61 nmol/g dw、0.68 nmol/g dw 和0.24 nmol/g dw; 后者分别为 0.74 nmol/g dw、0.26 nmol/g dw和0。50 cm以下包气带两者均未检出。

图4 厚层包气带不同深度沉积物PLFA(A)和Biolog (B)分析结果Fig.4 Results of Phosphor Lipid Fatty Acid (PLFA) (A) and Biolog (B) analysis of sediments from different depths in the thick vadose zone

Biolog ECO微孔板设计了3个重复的31种不同的碳源, 平均吸光值 AWCD(Average Well Color Development)(无量纲)反映了微生物对不同碳源的利用情况和利用程度, AWCD值越大, 微生物对碳源利用的能力越大, 样品的微生物活性越高。厚层包气带剖面13个不同深度土样的Biolog分析结果显示(图4B), 培养10 d后, AWCD值在浅表土壤层5 cm和20 cm处很高, 分别为0.90和0.93; 在砂层较小, 为0.32; 但是最小值出现在12.5 m粘土层上伏层, 为 0.057; 在包气带下部, 特别是在 DOC含量高层位附近AWCD值增大, 为0.72。AWCD值在剖面上的分布类型与PLFA和平板计数分布类型基本一致。

3.4 微生物群落多样性分布特征

对厚层包气带剖面不同深度土样进行总 DNA提取, 16 S rRNA基因片段PCR扩增和DGGE分析,得到如图5所示的DGGE图谱。DGGE图谱显示的条带是优势菌群, 每一条带代表一类细菌, 条带亮度越亮, 该菌含量越高。根据每一泳道的条带数,可知剖面不同深度微生物多样性。总体来说, 砂层以上包气带菌种类型较下部多, 在1.5 m到3.5 m层段菌种类型最多, 为17～21种; 在砂层为10～18种,在下部18～27 m, 除了DOC含量高的层段为14外,菌种类型很少, 为6～9种。对整个剖面53条明显条带切胶回收纯化克隆测序, 并将测序结果与已知GenBank数据库比对。结果显示, 厚层包气带剖面优势菌群主要是变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和一些目前还没有确定种类归属的类群(unclassified group)。变形菌门中α-变形菌最丰富。识别出19种已知菌, 如Acinetobactersp.(不动杆菌), Activated sludge bacterium GC_R2A_S_19(GC_R2A_S_19活性污泥菌株),Acinetobacter junii strain(琼氏不动杆菌),Boseasp.(包西氏菌),Comamonadaceae bacterium(丛毛单胞菌),Rumen bacterium(瘤胃菌),Bradyrhizobiaceae bacterium(慢性根瘤菌),Zoogloeasp.(动胶菌),Sinorhizobium meliloti(苜蓿中华根瘤菌),Herbaspirillumsp.(草螺菌),Hydrogenophagasp.(噬氢菌),Bacillus licheniformis strain(地衣芽孢杆菌)等。33种未培养菌, 其中4个条带序列相似性小于等于96%, 为疑似新种, 未培养菌群占细菌总数的 63%,说明剖面大部分细菌是不可培养的。

4 讨论

4.1 微生物含量、活性和多样性随深度变化的机制分析

微生物含量、活性和多样性在土壤层(5～20 cm)均较高, 在其下伏包气带较低, 这种现象在其它地区的包气带剖面也有报导(Balkwill et al., 1988;Kieft et al., 1998; Blume et al., 2002)。原因是土壤层营养丰富, 而下伏包气带营养锐减, 特别是DOC含量聚减。

图5 厚层包气带不同深度沉积物16 S rRNA基因DGGE图谱Fig.5 16 S rRNA gene denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) banding patterns for sediments from different depths in the thick vadose zone

下伏包气带微生物含量、活性和多样性还随岩性而变化。在亚粘土层含量、活性和多样性较高, 而在4.5～5.5 m的砂层和12.5 m的重粘土层含量、活性和多样性均较低。砂层粒间孔隙大, 水分、营养易流失, 从而影响微生物生长。剖面含水量、DOC、NO3–、SO42–和 Cl–在砂层含量均低的分析结果(图 2)得到证实。另外, 砂层孔隙大, 有利于微生物随水流向下运移, 也是砂层微生物含量、活性和多样性低的一个原因。砂层下紧邻的亚粘土层(7.5 m深处)营养和微生物含量、活性和多样性较高, 可能受到砂层的营养和微生物向下运移补给的影响。重粘土层中粒径小于0.2 μm的颗粒占45%, 粘土孔喉直径<0.2 μm, 而大部分微生物个体>0.2 μm, 导致微生物不能栖息其中和运移, 这是12.5m处重粘土层微生物含量、活性和多样性低的主要原因。重粘土层含水量较高(22.3%), SO42–和 Cl–含量出现峰值(分别为 179 mg/kg和 109 mg/kg), DOC含量较低(22 mg/kg), NO3–含量峰值(142.1 mg/kg)不是出现在重粘土层, 而是出现在其上的亚粘土层, 反映的是重粘土层本身化学组分特点, 以及重粘土层具有阻截上部包气带淋溶NO3–的作用。亚粘土孔隙大小介于砂岩和粘土之间, 有利于水分和营养的传输和微生物滞留, 因而亚粘土层微生物含量、活性和多样性较高。岩性影响微生物含量、活性和多样性的现象在其它地区也有报导(Chau et al., 2011)。

下伏包气带22 m层位及其附近微生物含量、活性和多样性增加, 取样时观察到该层位含有泥炭层, DOC在该层位出现峰值。古土壤有机质丰富,有利于微生物生长繁殖, 这种现象在其它古土壤也出现(Brockman et al., 1992)。

TNB、SAB、DB和IOB在整个厚层包气带剖面均有分布, 而NB1、NB2、SRB和MB仅在包气带上部或土壤层有分布, 而下部包气带很少或没有。NB1和NB2的分布主要是受NH4+的分布控制,灌溉的污水含有较多的 NH4+(65 mg/L)(张翠云等,2012), 但是NH4+易被粘土吸附, 不易向下迁移, 导致NB1和NB2分布在包气带上部。SRB和MB需在强还原环境下生长繁殖, 其分布主要受氧化还原条件的控制。间歇性的污水漫灌, 导致土壤层呈淹水与落水交替性地转换, 淹水时土壤层丰富的有机质有利于还原环境的形成, 而下伏包气带有机质有限, 不利于还原环境的形成, 因此, SRB和MB仅分布在土壤层, 而下伏包气带很少或没有。PLFA的分析也得到证明, 代表厌氧菌的 PLFA生物标记cy17:0和cy19:0仅在土壤层50 cm以浅有分布, 下部包气带均未检出。

SAB检测的细菌包括专性厌氧菌和兼性厌氧菌, 而且在整个包气带剖面均有分布, 但是从 SRB和MB在剖面的分布来看, 检测的SAB应该主要是兼性厌氧菌, 专性厌氧菌仅在土壤层有分布。

4.2 剖面生物自然衰减潜力分析

灌溉的污水含有各种污染物, 包括有机污染物、重金属和含氮化合物。从各种菌在剖面的含量、分布、活性和多样性来看, 土壤层(5～20 cm)生物自然衰减潜力最大。有机污染物可作为异养菌的碳源和能源, 通过微生物的呼吸作用使有机污染物降解,有机污染物可被一系列微生物利用, 除了好氧异养菌和兼性厌氧异养菌外, 还可被专性厌氧异养菌硫酸盐还原菌和产甲烷菌降解。重金属的自然衰减作用主要是吸附和沉淀作用, 但是微生物作用可促进这两种作用, 存在于土壤层的硫酸盐还原菌可使金属呈硫化物而沉淀, 从而阻止重金属向下运移。吸附和硝化作用是NH4+的主要自然衰减作用, NH4+被吸附后硝化, 使得硝化作用主要发生在包气带上部,特别是土壤层。

土壤层下伏包气带微生物含量、活性和多样性均减少或降低, 主要是好氧异养菌和兼性厌氧异养菌以及好氧自养菌, 其生物自然衰减的潜力不及土壤层, 但是仍然具有生物自然衰减潜力, 特别是在包气带下部 DOC含量高的层位, 其微生物活性在下伏包气带最大, 生物自然衰减潜力增大。

反硝化作用是NO3–生物自然衰减的主要作用。反硝化菌在整个剖面均有分布, 且含量很高。但是反硝化作用在剖面是否发生, 除了存在反硝化菌外,还必须具备还原环境(Korom, 1992)。从专性厌氧菌硫酸盐还原菌和产甲烷菌的分布来看, 下伏包气带主要是氧化环境, 不具备反硝化作用发生的还原条件。另外, 从氮同位素分析结果来看, NO3–-δ15N变幅很小, 指示没有或很少反硝化作用的发生(Zhang et al., 2013)。然而, 厚层包气带存在很高含量的反硝化菌, 指示厚层包气带具有原位刺激该菌生长和活性的潜力。

5 结论

1)传统和现代的微生物检测方法揭示污灌区厚层包气带微生物分布特征是, 土壤层微生物含量高,活性高, 代谢类型多, 异氧菌与自养菌、好氧菌、兼性厌氧菌和专性厌氧菌并存在; 下伏包气带微生物含量减少, 活性降低, 代谢类型减少, 主要是好氧异养菌和兼性厌氧菌以及好氧自养菌, 且受岩性控制, 在砂层和重粘土层含量低, 活性低, 在亚粘土层含量较高, 活性较高。

2)DGGE分析和测序揭示, 污灌区厚层包气带不同深度微生物多样性不尽相同, 包气带上部菌种类型较多, 下部相对较少; 剖面53个条带切胶测序比对结果显示, 优势菌群主要是变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和一些目前还没有确定种类归属的类群(unclassified group), 其中33种不可培养菌, 占细菌种类的 63%, 证实剖面大部分细菌是不可培养的。

3)污灌区土壤层(5～20 cm)具有很高的生物自然衰减潜力, 而且下伏包气带仍然具有生物自然衰减潜力, 特别是下部 DOC含量高的层位生物自然衰减潜力更大。

致谢:研究过程中, 得到了中国科学院生态环境研究中心呼庆博士在分子生物学实验方面的指导。特此致谢。

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