张红叶 郭宗科 董正邦 严翘 王飞

人乳头瘤病毒型别及载量与寻常疣临床特征相关性研究

张红叶 郭宗科 董正邦 严翘 王飞

目的探讨人乳头瘤病毒型别、载量与寻常疣临床特征的相关性。方法提取48例寻常疣组织DNA；正反向测序通用引物PCR扩增片段，通过blast比对分型，并通过型别特异性引物PCR来验证和补充测序结果；实时荧光定量PCR相对定量ΔCt法检测HPV病毒载量；HE染色法观察病理变化。结果35例HPV PCR检测阳性的标本中HPV 7型32例；HPV 57型1例，为四肢末端多发；HPV 2和HPV 7混合感染2例，为头面部、躯干多发病例。单发组与多发组、病程＜6个月组与病程6个月至1年组病毒载量、空泡化细胞数目无明显差异，1年后病毒载量有下降趋势，病程＞2年的皮损，角化过度更明显，空泡化细胞减少。结论寻常疣的HPV感染型别主要是HPV 7；HPV 7型感染好发于头面部；对于病程1年内的寻常疣，HPV病毒载量及空泡化细胞数目与其数目、病程长短无明显相关性。

人乳头瘤病毒；疣；病毒载量；疾病特征

寻常疣是常见的人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染皮肤黏膜引起的良性赘生物，其发病率高，可发生于身体任何部位，常好发于易受外伤部位，单发或多发，65%患者可在2年内自行消退[1]，部分则发展为巨大疣。寻常疣发病部位、单发与多发、病程长短与转归，病理变化，是否与感染的HPV特异性型别、病毒载量有关，目前研究不多。本研究通过通用引物PCR扩增后测序及型别特异性PCR检测寻常疣中HPV型别，实时荧光定量PCR相对定量ΔCt法测定病毒载量水平，分析HPV型别及载量与寻常疣临床表现及病理变化的相关性。

资料与方法

一、资料

1.病例资料:48例寻常疣皮损标本均来自东南大学附属中大医院皮肤性病科门诊就诊的典型的寻常疣患者，收集临床资料，包括性别、年龄、病程、皮损部位、皮损特征、单发或多发及随访情况。其中男30例，女18例，平均(43.5±19.7)岁(12～89岁)；单发组30例，多发组18例；头面部32例，四肢末端9例，躯干部9例；病程 ＜1年35例，病程 ≥1年13例，其中病程≥2年5例。6例正常包皮组织来自于东南大学附属中大医院泌尿外科就诊的包皮过长的患者，包皮提供者均签署知情同意书。同一患者同一部位的多发皮损，取一份标本；同一患者不同部位的多发皮损则分部位分别取材，一份用于型别载量的测定，一份用于病理检查。寻常疣组织标本及包皮组织于-80℃保存。本研究通过本院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

2.主要仪器和试剂:Eppendorf PCR基因扩增仪为德国Eppendorf公司产品，Gel Doc凝胶扫描成像系统为美国Bio-Rad公司产品，DY-A电泳仪为上海生化所西巴斯生物科技开发公司产品，HC-2518R高速冷冻离心机为合肥科大创新股份有限公司中佳分公司产品，电动组织研磨器为江苏大地自动化仪器厂产品，蛋白酶K为美国Sigma公司产品，Takara热启动酶反应盒为大连Takara公司产品，标准DNA Marker为美国Axygen公司产品。

3.引物:内参引物PC03/05、通用引物MY09/11均参照文献设计[2]，分别扩增人β珠蛋白209 bp、HPV L1 450 bp片段，PC03/05引物序列:上游引物5'-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3'、下游引物5'-GAAACCCAAGAGTCTTCTCT-3'；MY09/11 引物序列:上游引物5'-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3'、下游引物5'-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3'(混合碱基 M=A+C、R=A+G、W=A+T、Y=C+T)。根据文献中寻常疣感染的常见型别，对标本DNA 进行 HPV 2、4、7、27、57这 5个 HPV 型别的型别特异性引物PCR(TSP-PCR)，以上各型型别特异性引物均有两套，一套参照以往文献设计[2-3]，命名为TSP旧；一套由杭州赫贝科技有限公司设计，命名为TSP新，各套型别特异性引物序列、扩增片段及产物大小见表1。

表1 型别特异性引物序列、扩增片段及产物大小

二、方法

1.组织标本DNA的提取:称取约100 mg的组织，加入消化缓冲液，研磨至组织消失后加入蛋白酶k温育消化；分别加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)及等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，17 000 ×g、4℃离心15 min提纯，取上清；加入1/10体积的3 mol/L乙酸钠溶液和2体积的无水乙醇，-20℃中静置1 h后再同前离心30 min，弃上清；加70%乙醇振荡洗涤，加入TE缓冲液，使终浓度为1 mg/ml，-20℃保存。提取的DNA液以PC03/05扩增人β珠蛋白，验证提取模板质量。

2.HPV型别检测:DNA提取液以MY09/11为通用引物扩增HPV L1片段，反应体系为:缓冲液5 μl，dNTP 4 μl， 上下游引物各 0.8 μl，Takara 热启动酶0.3 μl，DNA 模板 6 μl，加 dH2O 至总体积 50 μl；扩增条件:预变性94℃ 2 min，变性94℃ 30 s，退火53℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，再延伸72℃ 5 min，循环数35。扩增产物琼脂糖凝胶电泳出现450 bp阳性条带的，扩增产物送华大基因公司处理，进行正反双向测序，对测序序列进行拼接后在NCBI的blast上比对，判定HPV型别。同时，每份DNA提取液均以表1所示的5个特异性型别HPV的两套引物系统作引物进行扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，判定是否为表1中的5个特异性型别。反应体系为: 缓冲液 2.5 μl，dNTP 2 μl， 上下游引物各0.4 μl，Takara 热启动酶 0.15 μl，DNA 模板 3 μl，加dH2O至总体积25 μl；扩增条件:预变性94℃2 min，变性94℃ 30 s，退火62℃ 30 s，延伸 72℃ 1 min，再延伸72℃ 5 min，循环数25。

3.HPV载量的实时荧光定量PCR检测:将HPV 7型的DNA提取液以表1中TSP 7新为引物扩增，进行HPV 7型病毒载量实时荧光定量PCR检测，由杭州赫贝科技有限公司完成，扩增条件:预变性95℃ 5 min，变性95℃ 25 s，退火 62℃ 30 s，延伸 72℃ 35 s，循环数40。结果依据2-ΔCt计算。

4.组织病理检查:疣体较大的寻常疣标本，将其一分为二，一半予4%甲醛固定后，进行HE染色，镜下观察，并对每个标本选取3个不同高倍镜(×400)视野进行空泡化细胞数目计数，取平均值代表组织空泡化细胞数目水平。

5.统计学方法:用SSPS 17.0软件进行统计学分析，对获得的病毒载量、组织病理空泡化细胞数目等数据以±s表示，对符合正态分布的各组数据用独立样本t检验，检验水准选择0.05。

结 果

一、HPV型别测定结果

48例寻常疣标本中，43例证实DNA提取成功；有5例提取失败，且其中2例为病程超过2年患者。6例正常包皮组织均提取DNA成功。

图1 通用引物MY09/11 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图 M:标准参照物；1～14:寻常疣组织标本；N:包皮组织标本

1.通用引物PCR测序分型结果:在DNA提取成功的43例中，35例均在450 bp处出现阳性条带(图1)；其中2例提取DNA成功的病程超过2年的病例，HPV通用引物PCR定性均阴性；6例正常包皮组织均未出现450 bp条带。35例中1例为HPV 57型，为四肢末端、多发、病程12个月的病例；其余34例均为HPV 7型。

表2 型别特异性PCR分型结果(例)

图2 寻常疣TSP-PCR琼脂糖凝胶电泳图 2a:HPV 7感染；2b:HPV 2/7混合感染；2c:HPV 57感染。M:标准参照物；1～5:分别为同一寻常疣组织标本的TSP新 2、4、7、27、57扩增产物；1*～5*:分别为同一寻常疣组织标本的TSP旧 2、4、7、27、57扩增产物

2.型别特异性PCR分型结果:两套引物的分型结果一致显示，1例同通用引物PCR测序结果为HPV 57型，2例为HPV 2和HPV 7混合感染型，为头面部、多发、病程＜1年病例，其中1例还合并有躯干部皮损；其余32例均为HPV 7型。具体分型结果见表2，图2。

二、HPV载量测定结果

选取HPV 7型感染的单发组、多发组各8个样本DNA进行实时荧光定量检测HPV病毒载量，其中14例病程在1年以内，1例为12个月，1例为18个月，这两例病毒载量均较其他病例明显减少，2-ΔCt结果分别为1978.165、773.259。组间载量情况比较，单发组与多发组、病程＜6个月组与病程6个月至1年组病毒载量差异无统计学意义。见表3。

三、组织病理结果

选取单发组、多发组各9例的皮损行组织病理检查，16例为HPV 7型感染、病程≤ 1年的病例，2例为提取DNA失败、病程 ＞2年的病例。HE染色，病理显示18例组织标本均表现典型的寻常疣组织病理改变，空泡化细胞计数:单发组与多发组、病程＜6个月组与病程6个月至1年组的空泡化细胞数目差异无统计学意义，P＞0.05(表4)；2例病程＞2年的空泡化细胞计数分别为19、22，比病程＜2年的角化过度更明显，空泡化细胞减少。

讨 论

表3 组间HPV载量情况比较(±s)

表3 组间HPV载量情况比较(±s)

组别 例数 载量2-ΔCt P值单发组 8 2189.77±853.06 ＞0.05多发组 8 2893.84±1093.18病程＜6个月组 9 2724.06±1067.07 ＞0.05 6个月至1年组 6 2531.00±656.11

表4 寻常疣组织病理空泡化细胞数目计数结果(±s)

表4 寻常疣组织病理空泡化细胞数目计数结果(±s)

组别 例数 空泡化细胞数目 P值单发组 9 42±15 ＞0.05多发组 9 41±10病程＜6个月组 8 44±13 ＞0.05 6个月至1年组 8 45±8

既往有关于寻常疣HPV型别的研究表明:在欧洲人群中寻常疣的感染型别主要是HPV2、27、57[4]，日本则为HPV1、4、65[5]，德国的主要流行型别是HPV1、2、4、10、27、57、65[6]。 在中国，Lei等[7]发现北京48例寻常疣标本HPV主要型别为 1、2、27、57。Chen等[8]发现中国台湾61例寻常疣标本主要型别为 HPV 1、2、4、5。 通过检测寻常疣的常见型别发现:HPV 4型可以导致病程的延长[9]；HPV 2与皮损形态有相关性[7]。感染HPV 2型的寻常疣更倾向于多发，皮损体积偏大，且对治疗疗效不好[10-11]；HPV 57有恶变倾向[12]，且多发生于掌跖部[13]。本实验在测定HPV型别的方法选取上，考虑到对于有混合感染的标本，HPV扩增效率不一样时或一种型别的HPV的量比另一种高很多，通用引物PCR可能使其中一型的产物占绝对优势，这时测序法就无法分辨出另一种型别，造成假阴性，故用通用引物PCR测序分型，再通过型别特异性引物PCR验证和补充通用引物PCR的测序结果。同时，本实验在型别特异性PCR的引物选取中，每个型别都通过两套引物系统扩增HPV不同的基因组区域进行验证，提高了结果的准确性。本实验中，型别特异性PCR检测2例为HPV 2、HPV 7混合感染的病例，而通用引物PCR测序分型却为HPV 7单一型别。

通过结合两种方法的型别测定，本实验中35例寻常疣HPV感染型别32例是HPV 7型，2例是HPV 2、HPV 7混合感染，1例是HPV 57型。32例HPV 7型寻常疣既有发生于四肢末端(11.1%)，也有发生于头面部(72.2%)，及躯干部(16.6%)，说明其主要发生于头面部，亦可发生于其他任何部位；这32例HPV 7感染患者也无职业特殊性，与皮损形态、单发或多发无特定关系。2例HPV 2型的感染，均为多发，且皮损形态都是菜花样成簇分布，这2例同时感染有HPV 7型，HPV 2、7均属于α-HPV，说明HPV 2型有合并同种属其他HPV型别的混合感染的倾向。其中1例HPV 2/7的感染，为发生于面部、躯干及肛周的多发皮损，说明HPV 2、7可以发生于肛周生殖器部位。本实验中只发现1例HPV 57感染，也是发生于手部的多发皮损，由于例数太少，无法确定其与寻常疣形态、数目的关联性。

由于PCR基因分型结果大部分寻常疣是HPV 7感染，故本实验中仅测定了HPV7型寻常疣的病毒载量，发现HPV 7型病毒载量与疾病的单发、多发无明显相关，与1年以内的病程长短亦无明显相关。本实验中观察到空泡化细胞数目多少与疾病的单发、多发及1年以内的病程长短无明显相关，而2例病程＞2年的皮损出现相对于病程＜2年的角化过度更明显，空泡化细胞减少的现象。而空泡化细胞是HPV病毒活力的象征[14]，空泡化细胞减少预示病毒对宿主细胞的致病性减弱，从而可以解释寻常疣可自行消退的临床表现。但此推论还需更多病程时间长的寻常疣组织标本的病理检查来进一步验证。

[1]赵辨.中国临床皮肤病学[M].南京：江苏科学技术出版社，2010：414-415.

[2]Sun C，Chen K，Gu H，et al.Association of human papillomavirus 7 with warts in toe webs[J].Br J Dermatol，2010，162(3)：579-586.

[3]Lei YJ，Gao C，An R，et al.Development of a multiplex PCR method for detecting and typing human papillomaviruses in verrucae vulgaris[J].J Virol Methods，2008，147(1)：72-77.

[4]Porro AM，Alchorne MM，Mota GR，et al.Detection and typing of human papillomavirus in cutaneous warts of patients infected with human immunodeficiency virus type 1[J].Br J Dermatol，2003，149(6)：1192-1199.

[5]Hagiwara K，Uezato H，Arakaki H，et al.A genotype distribution ofhuman papillomavirusesdetected by polymerase chain reaction and direct sequencing analysis in a large sample of common warts in Japan[J].J Med Virol，2005，77(1)：107-112.

[6]Iftner A，Klug SJ，Garbe C，et al.The prevalence of human papillomavirusgenotypesin nonmelanoma skin cancersof nonimmunosuppressed individuals identifies high-risk genital types as possible risk factors[J].Cancer Res，2003，63(21)：7515-7519.

[7]Lei YJ，Gao C，Wang C，et al.Molecular epidemiological study on prevalence of human papillomaviruses in patients with common warts in Beijing area[J].Biomed Environ Sci，2009，22(1)：55-61.

[8]Chen SL，Tsao YP，Lee JW，et al.Characterization and analysis of human papillomaviruses of skin warts[J].Arch Dermatol Res，1993，285(8)：460-465.

[9]Tomson N，Sterling J，Ahmed I，et al.Human papillomavirus typing of warts and response to cryotherapy[J].J Eur Acad Dermatol Venereol，2011，25(9)：1108-1111.

[10]Rübben A，Kalka K，Spelten B，et al.Clinical features and age distribution of patients with HPV 2/27/57-induced common warts[J].Arch Dermatol Res，1997，289(6)：337-430.

[11]Lei Y J，Wang C，Gao C，et al.HPV-2 Isolates from patients with huge verrucae vulgaris possess stronger promoter activities[J].Intervirology，2007，50(5)：353-360.

[12] Trujillo JM，Wu TC，Mounts P.Characterization of human papillomavirus type 57b：transforming activity and comparative sequence analysis as probes for biological determinants associated with high-risk oncogenic viruses[J].Virus Genes，1996，12(2)：165-178.

[13]Kitasato H，Egawa K，Honda Y，et al.A putative human papillomavirus type 57 new subtype isolated from plantar epidermoid cysts without intracytoplasmic inclusion bodies[J].J Gen Virol，1998，79(Pt 8)：1977-1981.

[14]Martelli-Marzagão F，Yamashiro AS，Ogawa MM，et al.Clinical and histopathological characterization and typing of the human papillomavirus in common warts of kidney transplant recipients[J].An Bras Dermatol，2010，85(5)：743-746.

2014-01-01)

(本文编辑:吴晓初)

Association analysis between human papillomavirus genotypes and viral load and clinical featuresof verruca vulgaris

Zhang Hongye*，Guo Zongke，Dong Zhengbang，Yan Qiao，Wang Fei.*Department of Dermatology，Nanjing Children's Hospital，Nanjing Medical University，Nanjing 210008，China

Wang Fei，Email：ffwangfei@163.com

ObjectiveTo study the association between human papillomavirus(HPV)genotypes and viral load and clinical features of verruca vulgaris.MethodsTissue samples were collected from 48 outpatients with verruca vulgaris，and DNA was extracted from these tissue samples.To determine the genotype of HPV，PCR was performed to amplify the L1 fragment of HPV with universal primers followed by bidirectional sequencing and BLAST.The genotyping results were validated by PCR with type-specific primers.Real-time fluorescence-based quantitative PCR was conducted to measure the viral load of HPV，and hematoxylin and eosin(HE)staining to observe histological changes in these tissue specimens.ResultsThe L1 fragment of HPV was amplified from 35 out of the 48 tissue specimens.Of the 35 L1-positive specimens，32 harbored HPV 7，1 harbored HPV 57，and 2 harbored both HPV 2 and HPV 7.Multiple lesions were observed on extremities in the patient infected with HPV 57，but on the head，face and trunk in the patients coinfected with HPV 2 and HPV 7.There were no significant differences in HPV viral load or vacuolated cell number between patients with single lesions and those with multiple lesions，or between patients with a clinical course of＜ 6 months and those with a clinical course of 6-12 months.However，HPV viral load tended to decrease one year after the onset，and there was pronounced hyperkeratosis and less vacuolated cells in lesions of long duration(more than 2 years)compared with those of short duration(less than 2 years).Conclusions HPV 7 appears to be the most common HPV genotype associated with verruca vulgaris，and HPV 7 infection usually occurs on the head and face.For verruca vulgaris of less than 1 year，neither HPV viral load nor vacuolated cell number is associated with the count or clinical course of warts.

Human papillomavirus；Warts；Viral load；Disease attributes

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.006

江苏省自然科学基金面上研究项目(BK2012748)；南京市科技发展项目(201104028)

210008南京医科大学附属南京儿童医院皮肤科(张红叶)；东南大学附属中大医院烧伤整形外科(郭宗科)，皮肤科(董正邦、严翘、王飞)

王飞，Email:ffwangfei@163.com