冀伟，刘瑞，常亮，于源华

（1.长春理工大学 生命科学技术学院，长春 130022；2.长春医学高等专科学校，长春 130013）

根据中国农业部的调查报告显示，全国已经发现被重金属污染的污水灌区占总体面积的64.8%以上［1］。每年的全国粮食总产量由于耕种用的土地受到重金属的污染而导致经济损失高达200亿元，相当于每年4000多万人失去基本生存用粮［2］。因此，对重金属污染的检测与治理刻不容缓。铅作为重金属中的一员，是被记载最多的有毒物质之一。城市环境铅污染主要来源于汽油燃烧产生的废气，含铅涂料，采矿、冶炼、铸造等工业生产活动，食品和水的铅污染，以及含铅杀虫剂、污泥施用于农业土壤等［3，4］。通过空气、饮水、食物进入生物体的铅会不断积累，超过一定量时便会引起各种疾病。处理重金属污染的传统方法多为物理化学法，如化学沉淀法、离子交换法、反渗透法等，存在投资大、能耗高、操作困难、易产生二次污染等缺点［5］。随着微生物学的发展，人们发明了具有操作简单、投资少、污染小、专一性强等诸多优点的生物修复技术，在去除环境重金属方面具有广阔的应用前景。一般情况下，在受重金属污染的地区都可筛选到抗重金属的微生物，这些抗性微生物有潜在的重金属吸附作用。因此，用重金属选择培养基，从中筛选出对土壤重金属具有专性高效富集作用的菌株，并进行分类鉴定，是微生物修复技术应用的前提［6］。

随着微生物学的进步与发展，人们发现像肺炎克雷伯氏菌［7］、浮游球衣菌［8］、Norcardia-amarae［9］、Phanerochaete chrysosportum［10］、Enterobacter sp.J1［11］、芽孢杆菌［12］、短小芽胞杆菌［13］、啤酒酵母菌［14］、拉微球菌［15］、镰刀霉菌属［15］、曲霉［16］、根霉［17］、靑霉［18］等微生物都具有一定的抗铅能力，但耐受能力普遍较低，大都小于400mg/L。本实验旨在寻找一种能抗高浓度铅离子的微生物，并对其生物学特征进行研究，将其鉴别并分类，为铅污染的检测与治理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

样品取自长春市绿园区电镀厂附近的土壤。

1.2 培养基

LB培养基：胰蛋白胨10gl/L，酵母浸粉5gl/L，NaCl，10gl/L。

固体LB培养基：胰蛋白胨10gl/L，酵母浸粉5gl/L，NaCl 10gl/L，琼脂粉15g/L。

选择培养基：LB培养基中分别加入Pb（NO3）2，使其终浓度分别为200mg/mL，300mg/mL，400mg/mL，500mg/mL，600mg/mL直至2000mg/mL。

1.3 菌株的筛选

称取1g电镀厂附近的土样制成不同稀释度的土壤稀释液；吸取200μL土壤稀释液，分别涂布在含有 100mg/mL Pb（NO3）2的固体 LB 平板上，静置15min，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养48h；根据菌落不同形态，挑取平板上的单菌落到5mL含有100mg/mL Pb（NO3）2的液体LB培养基中，37℃，180rpm/min，振摇培养13h；将获得的菌悬液反复涂布平板培养，直至革兰氏染色镜检为单一菌落，接种于液体LB液体培养基中，37℃，180rpm/min，振摇培养12～14h。

取培养后的菌悬液500μL接种到5mL含有100mg/mL Pb（NO3）2的液体LB培养基中，37℃，180rpm/min，振摇培养13h后，再将培养后的菌悬液接种至含有200mg/mL的Pb（NO3）2液体LB培养基中，相同条件培养；以此类推，至Pb（NO3）2的终浓度为 2000mg/mL，最终获得适应高浓度Pb（NO3）2的菌种，命名为FP 2000进行保存菌种。

1.4 革兰氏染色鉴定

用革兰氏染色法对FP2000菌进行革兰氏染色，镜检观察微生物形态。

1.5 生长曲线测定

取FP2000菌悬液100μL，接种在10mL液体LB培养基中，37℃恒温条件下，180rpm/min振摇培养13h；取250μL的菌悬液分别接种到16支相同并编号的装有5mL LB液体培养基的试管中，37℃，180rpm/min，振摇培养；分别于time（h）=0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5时取出一管，测定不同时间菌悬液的OD595值，绘制其生长曲线。并以培养时间为横轴，OD595值为纵轴作图。

1.6 最适生长温度测定

将活化后的菌悬液按1∶50的比例分别接种于5ml液体LB培养基的试管中，分别于27℃，28℃，29℃，30℃，31℃，32℃，33℃，34℃，35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃，41℃，42℃，43℃条件下，180rpm/min，振摇培养5h后取出菌悬液，分别测定菌悬液OD595值，并绘制出FP 2000的最适生长温度曲线。

1.7 最适生长pH值测定

配制pH值分别为5，6，7，8，9的LB液体培养基，取250μL菌悬液接种于5mL的LB培养基中，37℃，180rpm/min，振摇培养5h后，分别测定菌悬液OD595值，并绘制出FP 2000的最适pH值曲线。

1.8 对Pb2+等有毒重金属离子的耐受性测定

为了探究FP 2000的对其他重金属的抵抗能力，本实验用FP 2000对Cd2+，Ag+，Zn2+，Ni2+，Cu2+重金属的敏感性进行了测试。分别配制含有终浓度为100mg/mL，500mg/mL，1000mg/mL和2000mg/mL的Pb2+，Cd2+，Ag+，Zn2+，Ni2+，Cu2+的LB液体培养基，将活化的菌悬液和对照组普通BL 21大肠杆菌按1：50的比例接种于5mL LB培养基中，37℃，180rpm/min，振摇培养5h后，分别测定菌悬液吸光度OD595的数值，并绘制出在不同浓度下，FP 2000的对不同金属的耐受性。

1.9 16S rDNA分析

16S rDNA的PCR扩增：提取FP 2000菌的基因组DNA，以细菌的总DNA为模板，克隆引物采用上海生工公司16S rDNA通用引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACT T-3’和 27F：5’-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3’，进行PCR扩增。PCR的反应体系（50μL）：DNA模板1μL，10×Taq reaction Buffer 5μL，正向引物8F和反向引物1492各1μL，Taq酶0.25μL，dNTP 1μL，扩增程序为：98℃预变5min，95℃变性35s，55℃复性35s，72℃延伸90s，循环3次，最后72℃延伸8min（16S rDNA序列的测定由上海生工生物技术有限公司完成）。根据测序得出的结果进行系统进化树分析，对FP 2000菌进行鉴定。

2 实验结果与讨论

2.1 FP 2000的分离、筛选和鉴定

对筛选的FP 2000进行革兰氏染色，显微镜观察。观察到结果为FP 2000染色后呈短棒状红色细菌（见图1），因此判定该菌为革兰氏阴性菌。

图1 FP 2000菌革兰氏染色40x镜检结果

2.2 菌生长条件的测定

2.2.1 生长曲线

以FP 2000的生长时间为横坐标，吸光度OD595的值为纵坐标，并绘制生长曲线，如图2。从生长曲线来看，FP 2000在3～7h达到对数生长期，7～9h，细菌生长达到迟缓期，9h以后为衰亡期。

图2 FP2000菌的生长曲线

2.2.2 最适生长温度

以细菌生长温度为横坐标，吸光度OD595的值为纵坐标，绘制FP 2000菌的最适生长温度曲线，如图3所示，可以看出FP 2000菌的最适温度为34℃～40℃。

图3 FP 2000菌的最适生长温度

2.2.3 最适生长pH值

以不同pH值为横坐标，吸光度OD595的值为纵坐标，并绘制FP 2000菌的最适pH生长曲线，如图4，从图中可以看出该菌株的最适生长pH为4.5-6，当pH值大于7时，生长速度迅速下降。原因是铅需要在酸性条件下才能以铅离子形态存在，因此抗铅离子的菌株也能适应酸性生长条件。

图4 FP 2000菌的最适生长pH值

2.2.4 不同重金属的耐受性

图5表示出了FP 2000的抗铅能力，图中所反映的是BL 21大肠杆菌和FP 2000在不同浓度Pb2+的培养基中的生长状况，可以看出，在Pb2+浓度较低（0mg/L和100mg/L）时，37℃，180rpm培养5h后，在595nm下测得的OD值在1.3-1.7之间，生长状况差异比较小，但随着Pb2+浓度升高（100mg/L和2000mg/L），两种菌在595nm下测得的OD值都有所下降，BL 21大肠杆菌的生长明显受到了Pb2+的抑制，而FP 2000菌生长的OD值下降速度较缓，在1.0以上，说明FP 2000菌具有对Pb2+的抗性，并可在Pb2+浓度达2000mg/L的培养基中正常生长。

图5 FP 2000菌的抗铅能力

如图6、图7所示，重金属的浓度较低（100mg/L）时Pb2+、Zn2+和Ni2+离子对该菌的生长影响很小，在5h后吸光度与对照组差别并不大，而Cd2+和Ag+则明显影响了该菌的正常生长；当金属离子浓度较高时（500mg/L）时，Cd2+，Ag+，Zn2+，Ni2+对该菌的抑制作用比较明显，菌液的吸光度均小于1.0，而Pb2+对该菌生长状况影响不大，这说明FP 2000菌对Pb2+具有抗性的，而对Cd2+，Ag+，Zn2+，Ni2+抗性较低。

图7 FP 2000菌对高浓度重金属的耐受性

2.3 FP 2000菌16S rDNA的提取及鉴定

将测序获得的16S rDNA序列美国基因数据库（Gen-Bank）比对，对获得的同源序列进行序列分析，采用MEGA 5.05软件构建进化树。如图8所示。该菌的16S rDNA序列与克雷伯氏菌同源性达到99%，因此可以判定FP 2000菌属于克雷伯氏菌。

图8 FP 2000菌系统进化树

3 结论

从电镀厂附近的土壤中，分离、筛选出1株高对浓度为2000mg/L的Pb（NO3）2具有抵抗能力的细菌：FP 2000。对FP 2000该菌进行革兰氏染色，并对该菌株16S rDNA进行测序比对，结果表明：FP 2000为革兰氏阴性菌，该菌是归属于克雷伯氏菌；并对该菌进行条件优化实验，最适合的生长条件为：温度34～40℃，pH值4～6，在普通LB液体培养基中3～7小时达到对数生长期，以上结论说明该菌对环境条件要求较低，有很好应用前景。

对于该菌的耐铅机制，目前还不清楚。今后将开展对菌株降解动力学、降解途径、细菌降解后产物以及降解含丙烯酰胺污水的室内实验研究。

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