刘红军，朱红梅，程祝强，金 毅，徐建国

吗啡是肿瘤患者术后镇痛和癌痛治疗常用药物，研究表明吗啡在镇痛同时可对肿瘤细胞的生长和转移产生影响，其机制可能与抑制自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)活性等有关［1-4］。鉴于吗啡具有免疫抑制作用，许多其他药物亦被用于替代吗啡镇痛。其中曲马多由于镇痛效果好，不良反应小而被广泛使用［5］。有研究［5-6］认为，等效镇痛剂量的曲马多和吗啡相比，可有效减轻手术应激和疼痛所致的免疫抑制，并且曲马多不会对细胞免疫功能产生抑制作用，相反可增强NK细胞活性和促进白细胞介素-2(IL-2)的产生。但肿瘤的生长和转移除了机体抗肿瘤免疫机制的间接作用外，还与肿瘤细胞自身的生长增殖能力有关。既往研究表明吗啡可与细胞表面阿片受体结合，调节细胞的生长，但具体机制仍不清楚［7-8］;关于曲马多对肿瘤细胞增增殖和凋亡的影响尚无研究。因此本研究拟通过离体实验，研究等效镇痛剂量吗啡和曲马多对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响，并对其机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与器材 硫酸吗啡、β-Actin鼠源单抗(美国Sigama公司);曲马多(德国格兰泰有限公司);大鼠乳腺癌细胞系 MADB106(上海通派生物科技有限公司);Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、RPMI-1640(美国GIBCO公司);FBS(美国ExCell Biology公司);MTT(美国Amresco公司);96孔、24孔与6孔细胞培养板(美国Corning Incorporated公司);半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)抗体、半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)抗体、激活型caspase-3抗体、激活型caspase-8抗体(美国Cellsignaling公司)。图像分析软件Image J(NIH公司);垂直电泳槽(Bio-Rad公司);超净工作台(中国苏州净化 SW-CJ-1FD);CO2培养箱(日本SANYO公司);EL-x800酶标仪(美国BioTek公司);流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 MADB-106乳腺癌细胞株经含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基在37℃，湿度为95%，体积分数为5%的CO2培养箱中培养。组别:空白对照组，溶剂对照组，吗啡Ⅰ组(1 nM)，吗啡Ⅱ组(1 μM)，吗啡Ⅲ组(1 mM)，曲马多Ⅰ组(10 nM)，曲马多Ⅱ组(10 μM)，曲马多Ⅲ组(10 mM)。

1.2.2 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡将浓度为5×105个/mL MADB-106乳腺癌细胞消化接种到六孔板中，待细胞贴壁后，根据实验分组分别加入相应的含药培养基，同时设立阴性对照组;药物作用24 h后，用0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集、洗涤细胞，各组分别加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，加入 5 μL Propidium Iodide，混匀;室温、避光、反应5～15 min;用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖 将细胞消化、计数、配制成浓度为5×104个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100 μL细胞悬液，培养24 h后洗涤细胞两次。用完全培养基稀释吗啡和曲马多至所需浓度，每孔加入200 μL相应的含药培养基，将96孔细胞培养板置于37℃，5%CO2培养箱中培养24 h;将96孔板进行MTT染色，采用酶标仪测定吸光度值(OD值)，λ=490 nm，计算不同浓度吗啡和曲马多对肿瘤细胞的抑制率及药物半抑制浓度(IC50)［9］。

抑制率(%)=(阴性对照组－实验组)/阴性对照组×100%。

1.2.4 Western blot法检测 caspase-3 和 caspase-8表达 每1×106细胞加入50 μL细胞溶解缓冲液，充分裂解细胞，离心取上清液，按说明书操作，加入各类相关试剂。内参为β-Actin(1∶1000)，测定条带灰度值，以目的条带灰度值与内参灰度值的比值反映caspase-3、caspase-8、激活型 caspase-3和激活型caspase-8的表达水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni法，P＜0.05为差异有统计学意义。以机率单位加权回归法(Bliss法)计算IC50。

2 结果

2.1 不同浓度吗啡和曲马多对肿瘤细胞凋亡的影响 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测结果表明，不同浓度的吗啡和曲马多与肿瘤细胞直接作用24 h后，剂量依赖性诱导肿瘤细胞凋亡(图1)。由表1可知，等效镇痛浓度的吗啡与曲马多并无差异(P ＞0.05)。

图1 流式检测不同浓度吗啡和曲马多对肿瘤细胞凋亡的影响

表1 各组细胞凋亡率

2.2 不同浓度吗啡和曲马多对肿瘤细胞增殖的影响 见表2。结果显示吗啡与曲马多均浓度依赖性抑制肿瘤细胞的增殖。吗啡抑制肿瘤细胞增殖的IC50为11.3 mM，曲马多抑制肿瘤细胞增殖的IC50为31.3 mM。

表2 MTT检测不同浓度吗啡和曲马多对肿瘤细胞增殖的影响

2.3 各组caspase-3和caspase-8表达变化 吗啡1 mM和曲马多10 mM分别与肿瘤细胞作用24 h后各组总的caspase-3和caspase-8蛋白表达无明显差异，而二者的激活片段则出现了显著的改变，吗啡组和曲马多组caspase-3激活片段表达均增加(表3，P＜0.05)，但caspase-8激活片段仅吗啡组表达增高，曲马多组无明显变化。

表3 各组caspase-3和caspase-8表达变化(%，±s)

表3 各组caspase-3和caspase-8表达变化(%，±s)

注:与空白对照组和溶剂对照组比较，*P＜0.05

caspase-8空白对照组组别 激活型caspase-3 激活型0.33 ±0.02 0.24 ±0.02溶剂对照组 0.36 ±0.02 0.28 ±0.01吗啡1 mM 0.68 ±0.03* 0.49 ±0.03*曲马多 10 mM 0.67 ±0.01*0.27 ±0.02

3 讨论

肿瘤细胞的增殖和凋亡对肿瘤的发生、发展以及预后和复发具有重要意义。本研究体外细胞实验结果表明吗啡和曲马多均可浓度依赖性抑制肿瘤细胞的生长，促进细胞的凋亡，这与以前研究［12-15］相一致。但本研究结果与前研究［13-14］也有所不同，笔者发现1 nM吗啡即可促进MADB-106乳腺癌细胞的凋亡，等效镇痛浓度的曲马多同样可促进细胞凋亡。而Tegeder等［10］研究认为高浓度的吗啡(＞10 μM)可显著抑制MCF-7和MDA-MB-231肿瘤细胞的生长。

尽管进行了大量的研究，但吗啡等阿片类药物调节肿瘤细胞增殖和凋亡的具体机制仍不清楚。阿片受体不仅在外周神经和中枢神经系统表达，在许多正常细胞和肿瘤细胞表面同样存在［1，11］。吗啡可与细胞表面阿片受体结合，从而调节细胞的生长。其机制包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)、C-Jun氨基末端激酶的激活，活性氧、NO的产生，促凋亡的Bim表达增加，抗凋亡的Bcl-2表达降低以及p53、NF-κB介导的细胞信号通路等［12-15］。曲马多则具有双重镇痛机制，一方面可与μ受体结合，另一方面可激活中枢单胺能系统，抑制5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素的摄取。本研究结果表明曲马多和吗啡一样，同样可浓度依赖性抑制肿瘤细胞的增殖，促进细胞的凋亡，并且等效镇痛浓度的吗啡与曲马多并无差异。既往研究认为不仅仅是阿片受体还有其他受体系统参与肿瘤细胞增殖，如生长抑素受体、阿片与烟碱和雌激素信号途径的相互作用等［16-17］。因此笔者推测曲马多调节肿瘤细胞的增殖与凋亡的机制除了与μ受体作用以外，中枢单胺能系统同样在其中发挥重要作用。

吗啡与阿片受体结合后通过下游何种信号途径最终产生细胞凋亡尚不清楚。尽管目前对凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定半胱氨酸蛋白酶(caspase)在凋亡过程中是起着至关重要作用［18］。目前主要的细胞凋亡通路均与caspase激活有关。细胞凋亡的过程即是caspase不可逆水解底物的级联放大反应过程。参与诱导凋亡的caspase分成两大类:启动酶和效应酶，它们分别在凋亡信号转导的上游和下游发挥作用。启动caspase包括启动caspase-8，9，10。启动 caspase可发生同源活化，在细胞凋亡过程中最早发生。启动caspase活化后，即开启细胞内的死亡程序，通过异源活化方式水解下游caspase将凋亡信号放大，同时将死亡信号向下传递。被异源活化的caspase即效应caspase，包括caspase-3，6，7。本 研 究 结 果 表 明 caspase-3 和caspase-8信号通路参与了吗啡诱导的乳腺癌细胞的凋亡。这与既往研究结果相一致［12］，但本研究结果表明曲马多与吗啡诱导肿瘤细胞凋亡的机制并不完全相同，曲马多仅增加caspase-3激活片段的表达，而对caspase-8激活片段的表达并无明显影响。表明与吗啡促进肿瘤细胞凋亡过程不同，曲马多可能通过其他通路最终激活 caspase-3，中间并不通过caspase-8通路的激活。其具体通路尚有待研究。

总之，吗啡和曲马多均可浓度依赖性促进MADB-106乳腺癌细胞的凋亡、抑制肿瘤细胞的生长与增殖。吗啡和曲马多诱导MADB-106乳腺癌细胞的凋亡均与caspase-3途径有关，吗啡可能通过激活caspase-8从而激活caspase-3途径，而曲马多激活caspase-3途径与caspase-8激活无关。

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