曾凡业，樊玉祥，何文婷，帕提玛，王锐，张洪亮

（新疆医科大学附属中医医院肿瘤科，乌鲁木齐 830000）

胃癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，其病死率居所有消化道肿瘤第一位，严重威胁着人类的健康［1］。β－咔啉类生物碱是一大类天然来源的生物碱，在自然界分布广泛，其中以蒺藜科多年生草本植物骆驼蓬种子中提取出的β－咔啉类生物碱最为常见，其主要成分为去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱，实验证明二者具有一定的抗肿瘤作用，但具体的作用机制目前尚未明确［2－4］。本研究从形态学方面分析β－咔啉类生物碱对人胃癌细胞株SGC－7901细胞凋亡的影响，为进一步临床研究提供依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 β－咔啉类生物碱与人胃癌细胞株 β－咔啉类生物碱取自新疆道地药材骆驼蓬，采用电喷雾质谱技术，富集浓度为30%；人胃癌SGC－7901细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.2 实验试剂及仪器 RPMI－1640培养基、胚胎牛血清、双抗、胰蛋白酶和PBS均购自美国HyClone公司；Hoechst 33258染液购自美国sigma公司；超净工作台（苏州净化有限公司），酶标仪（1500，美国Thermo公司），细胞培养箱（美国Thermo公司），荧光显微镜（DMI6000B，德国Leica公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验试剂制备 β－咔啉类生物碱使用二甲基亚砜（DMSO）溶解，1 000r／min离心5min后取上清液，用0.22μm孔径无菌滤膜除菌，置于4℃冰箱备用。人胃癌细胞株用含有10%胚胎牛血清＋0.5%双抗（青霉素、链霉素）RPMI－1640培养基培养，将细胞置于环境为37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，实验时取用对数生长期的细胞。

1.2.2 电镜前准备 使用胰蛋白酶消化法消化细胞，倒置显微镜下观察细胞变圆、细胞胞质回缩，当细胞间不再连接成片时，加入含有胚胎牛血清及双抗的RPMI－1640 2mL终止消化。使用移液器反复吹打，尽可能使细胞脱落。将含有细胞的溶液转移至15mL离心管中，在1 000r／min，5min条件下离心。离心结束后，弃除上清液，加入含有胚胎牛血清及双抗的RPMI－1640，反复吹打，制备单细胞悬液。同时使用血球计数板行细胞计数，调整细胞浓度为（2～4）×105／mL，分别装于培养瓶中，在细胞培养箱中培养24h后，观察细胞贴壁情况，选择贴壁良好的培养瓶，每瓶加入1mLβ－咔啉类生物碱溶液，其浓度分别为0、5、10、20、40μg／mL。空白对照组加入1mL含有胚胎牛血清及双抗的RPMI－1640培养基。

1.2.3 SGC－7901细胞株超微结构变化 待药物作用48h后，收集细胞后使用2%戊二醛固定2h后，再次使用锇酸固定，行乙醇梯度脱水、环氧树脂包埋、切片，醋酸铀及柠檬酸染色后，行透射电镜观察。

1.2.4 SGC－7901细胞株凋亡形态改变 取对数生长期细胞，调整细胞浓度为（3～5）×108／mL单细胞悬液，置入6孔板中培养24h，选取贴壁良好的细胞弃去上清液，加入含β－咔啉类生物碱浓度为5、10、20、40μg／mL培养基0.5mL，对照加入等体积培养液。置入培养箱48h后，弃去上清液，PBS冲洗2次，加入甲醇与冰醋酸比例为3∶1的混合液于4℃下固定10min，每孔加入0.5mL Hoechst 33258染液染色15min，置于荧光显微镜下观察并记录实验结果。

1.3 统计学方法

实验记录数据使用SPSS17.0统计学软件进行分析，结果以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SGC－7901细胞超微结构变化

透射电镜结果显示：经不同浓度β－咔啉类生物碱作用48h的SGC－7901细胞可见一系列凋亡特征性的形态学改变，如细胞表面绒毛突起减少、细胞核内线粒体趋于减少、核内染色质固缩、胞浆内空泡增多，且随药物浓度增加凋亡表现越明显（见图1）。

图1 不同β－咔啉类生物碱浓度作用SGC－7901细胞株48h后细胞改变情况

2.2 SGC－7901细胞形态变化

经不同浓度β－咔啉类生物碱作用48h，荧光显微镜下可见：细胞核固缩、核内染色质在局部区域内凝集、致密浓染、部分可见核碎裂、出现凋亡小体（见图2）。β－咔啉类生物碱（0、5、10、20、40μg／mL）作用下SGC－7901细胞凋亡率分别为（3.25±025）%、（6.30±0.39）%、（9.34±0.54）%、（11.33±0.37）%、（19.86±0.55）%。0μg／mL组分别与其他药物浓度组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），经两两比较结果显示：随着β－咔啉类生物碱作用浓度增加，SGC－7901细胞凋亡率有所增加（见图2）。

图2 β－咔啉类生物碱作用SGC－7901 48h后细胞凋亡形态变化

3 讨论

细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是在基因严密调控下发生的主动性自我消亡过程。1972年Kerr等［5］详细描述了凋亡细胞超微结构的变化，包括胞浆浓缩，边缘化，核染色质固缩，晚期核片段化、碎裂，被膜包裹隆起，形成凋亡小体。尽管细胞凋亡是一种自主过程，但其可以被多种病理刺激诱导。同时，凋亡细胞不产生组织炎症反应，因此如何引导肿瘤细胞正常凋亡过程，成为近年来抗肿瘤药物研制的发展方向［6］。

β－咔啉类生物碱是一类天然来源和化学合成的生物碱，以去氢骆驼蓬碱最具代表性。近年来，去氢骆驼蓬碱或骆驼蓬碱广泛应用于治疗肿瘤的临床实验中，张晓凯等［7］报道了去氢骆驼蓬碱能诱导人胰腺癌AsPC－1细胞的凋亡和自噬；曹明溶等［8］报道了骆驼蓬碱通过诱导细胞凋亡而起到抗肝癌HepG2细胞株增殖的作用；另外，有研究显示去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱混合生物碱对胃癌细胞具有生长抑制作用［9］。本实验所采用的β－咔啉类生物碱通过电喷雾质谱仪制取，对骆驼蓬生物总碱经行纯化，在药物层面能够最大限度地排除干扰因素［10］。

通过透射电镜观察人胃癌SGC－7901细胞凋亡，结果显示细胞表面微绒毛减少，但未直接观察到典型的凋亡细胞，这可能与电镜切片样本含量不足或药物浓度不足有关。荧光显微镜下运用Hoechst 33258染色，能够显示细胞核固缩和断裂情况［11，12］。该方法观察凋亡细胞核染色特点的同时，还可以进行初步计数，结合药物浓度计算细胞凋亡率。本组实验中，β－咔啉类生物碱在5、10、20、40μg／mL浓度的细胞凋亡率分别与0μg／mL组比较，差异有统计学意义。然而，本研究尚未对不同浓度药物影响下细胞凋亡关系做进一步分析。国内研究中，张强等［13］报道了人胃癌细胞SGC－7901凋亡和复方青龙衣不同浓度梯度之间的关系，邓淑文等［14］研究发现姜黄素可呈剂量依赖性明显抑制SGC7901的生长。因此，对于β－咔啉类生物碱抑制SGC－7901的细胞浓度依赖性仍需进一步研究确定［15，16］。

综上所述，β－咔啉类生物碱对人胃癌细胞株SGC－7901细胞凋亡具有潜在诱导作用，后续研究可以从细胞凋亡的药物浓度依赖性方面开展，为其抗肿瘤制剂的研制和临床实验提供依据。

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