赵光华 马红芳 董小海 胡京枝

（河南省农科院农业质量标准与检测技术研究所，河南郑州 450002）

志贺氏菌是一类具有高度传染性的肠道致病菌，人类和灵长类是其适宜宿主。但近年来，越来越多的动物病理研究表明，志贺氏菌除感染人类引起痢疾之外，还能感染猴、犊牛、仔猪、鸡、鸭等动物，成为动物的新发病原菌[1-2]。志贺氏菌极易产生耐药性，并且能在养殖场内发生水平、垂直传染，给养殖企业管理带来很大困难，有时甚至会造成重大经济损失。随着养殖规模的扩大、饲料工业的发展，动物源性成分在饲料中的使用比例逐渐增高，由此带来饲料受致病菌污染的风险逐渐增大。因此，饲料受志贺氏菌污染的风险也在迅速提高[3]。

生物技术的发展，带动了志贺氏菌的检验技术也在不断完善，目前已形成常规生化鉴定方法、免疫学方法、分子生物学方法等三大类方法[4]。各类方法均有明显的优缺点，但生化鉴定方法是唯一的仲裁国标方法，具有相当高的鉴定准确性，大多数的法定检验机构都在使用该方法，但也存在一定的漏检率，特别是菌相复杂、干扰菌比较多的情况下，漏检率更高[5]，对养殖企业、饲料生产企业等带来很多非常不利的影响，甚至产生严重的经济损失。本研究结合检测工作实际，对国标生化鉴定方法检测饲料中志贺氏菌过程中存在的问题进行了优化试验，提出了很好的优化方案，经历了实际工作的检验，进一步提高了饲料中志贺氏菌检测的准确性，取得了良好的检测效果。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

大肠埃希氏菌（Escherichia coli,CMCC44102）、志贺氏菌（Shigella,CMCC51571）、沙门氏菌（Salmonella,CMCC50071），中国药品生物制品检定所；肠道增菌肉汤、GN增菌液、志贺氏菌增菌液、XLD培养基、HE培养基、EMB培养基、SS培养基、沙门氏菌生化鉴定管、志贺氏菌生化鉴定管、大肠埃希氏菌生化鉴定管，青岛海博生物工程公司。

全自动微生物鉴定系统（BIOLOG MicroStationTM）、GENⅢ细菌鉴定板（GEN III MicroPlateTM），美国BIOLOG公司。

电热恒温培养箱、生物显微镜、电子天平等。

1.2 方法

1.2.1 增菌培养基的优化试验

分别取沙门氏菌、志贺氏菌、大肠埃希氏菌斜面菌株各一接种环，接种于100 ml营养肉汤培养基中，37℃培养18 h，然后分别转种于肠道增菌肉汤、GN增菌液、志贺氏菌增菌液中，接种量为一接种环，37℃培养6 h。培养物在EMB平板上划线分离，37℃培养18 h，观察菌落生长情况。各随机挑选10个菌落，用全自动微生物鉴定仪并加血清学试验进行鉴定，分析不同增菌培养基对志贺氏菌的增菌效果。

1.2.2 增菌时间及增菌条件的优化试验

将沙门氏菌、志贺氏菌、大肠埃希氏菌营养肉汤混合培养物分别接种于两组1.2.1中对志贺氏菌增菌效果最好的增菌液中，接种量各一环，一组于37℃好氧条件下分别培养0.5、6、20，另一组于37℃厌氧条件下分别培养0.5、6、20。将两种培养条件不同培养时间的增菌液分别于EMB平板上划线分离，37℃培养18 h，观察菌落生长情况。并随机挑选10个菌落，用全自动微生物鉴定仪并加血清学试验进行鉴定，分析不同增菌培养基对志贺氏菌的增菌效果。

1.2.3 选择性分离培养基的选择

取1.2.1中的对志贺氏菌增菌效果最好的混合增菌液，分别于XLD、HE、SS、EMB培养基平板上划线分离，37℃培养18 h,观察菌落生长情况，记录志贺氏菌疑似菌落和杂菌菌落。挑选10个疑似菌落，用全自动微生物鉴定仪并加血清学试验进行鉴定，分析不同分离培养基对志贺氏菌的选择性分离效果。

1.2.4 生化试验

对1.2.3中XLD分离培养基上挑选的10株疑似志贺氏菌分别进行营养琼脂斜面纯培养，分别用志贺氏菌生化鉴定管和GENⅢ细菌鉴定板进行生化鉴定试验，结合血清学鉴定结果，分析两种生化鉴定方法的准确性。

2 结果

2.1 由表1可知，选择三种增菌液分别增菌6 h后，在EMB平板上分离验证，志贺氏菌增菌液在有沙门氏菌、大肠埃希氏菌干扰的情况下对志贺氏菌的选择性增菌效果最好。随机挑选的10株菌中，经鉴定志贺氏菌有6株，占60%的比例，这是因为增菌液中添加了新生霉素提高了对沙门氏菌的抑制作用，减少了沙门氏菌的干扰。肠道增菌液和GN增菌液在有沙门氏菌、大肠埃希氏菌干扰的情况下，对志贺氏菌的选择性增菌效果不显著，肠道增菌液中大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌均得到增殖，未体现出对志贺氏菌的选择性，GN增菌液中沙门氏菌增殖效果较好，可能是沙门氏菌的优势增殖抑制了志贺氏菌的生长。

表1 3种肠道增菌液对志贺氏菌增菌效果比较

2.2 由表2可知，志贺氏菌增菌液在不同增菌时间、不同增菌条件下对志贺氏菌的选择性增菌效果差异明显。试验结果显示，37℃厌氧增菌条件下，不同增菌时间对志贺氏菌的增菌选择性均比37℃好氧条件下的选择性好，特别是存在沙门氏菌、大肠埃希氏菌干扰的情况下，这很符合饲料样品中的菌相特征。因为志贺氏菌、大肠埃希氏菌均为兼性厌氧，所以厌氧条件下抑制了沙门氏菌的快速增殖。在增菌时间上，增菌6 h时对志贺氏菌的选择性最好，随着增菌时间的延长，选择性又有降低的趋势。

表2 志贺氏菌增菌液中不同增菌时间、不同增菌条件对志贺氏菌增菌效果比较（%）

2.3 XLD、HE、SS、EMB四种培养基中，均含有乳糖成分，抑菌剂、酸碱指示剂等略有不同，典型的志贺氏菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌均可形成典型菌落，具有较好的选择性，但在检测宋内氏志贺氏菌时，因其乳糖发酵阳性，与大肠埃希氏菌、乳糖迟缓阳性的沙门氏菌在XLD、HE、SS、EMB四种培养基上具有相似的培养特性，选择性较差。但在检测实践中，经多次试验，仍然发现上述四种分离培养基对志贺氏菌的选择性分离有明显差异，结果见表3。从上述四种培养基中挑选出的各10株疑似志贺氏菌，经后续鉴定，XLD培养基上鉴定志贺氏菌的准确率最高，EMB培养基的准确率最低，故可优先选用XLD培养基。

2.4 志贺氏菌的生化反应复杂，常规生化试验因人员影响、试剂影响等造成试验误差较大，本试验选用美国BIOLOG全自动微生物鉴定仪结合GENⅢ细菌鉴定板进行自动化生化鉴定试验，鉴定准确率高，结果重现性好，克服了人员和试剂误差，鉴定结果见表4。

从表4可以看出，不论是福氏志贺氏菌还是生化反应明显不同的宋内氏志贺氏菌，BIOLOG全自动微生物鉴定仪结合GENⅢ细菌鉴定板均能准确鉴定出结果，鉴定结果的可信性高达100%，并且在18～48 h的培养 时间内，鉴定结果非常稳定。

表3 不同选择性培养基对志贺氏菌的分离效果比较

表4 BIOLOG全自动微生物鉴定仪对志贺氏菌的鉴定结果

3 讨论

3.1 本试验是利用阳性菌株添加的方法进行试验设计，样品菌相明确。在实际样品检测过程中，样品菌相复杂，但沙门氏菌、大肠埃希氏菌是最主要的干扰菌，与本试验设计的干扰因素是一致的。在对疑似菌落进行确证试验时，阳性率比本试验结果偏低，因此在分离平板上挑选可疑菌落时，应增大挑选可疑菌落的数量，特别是存在沙门氏菌、大肠埃希氏菌干扰的情况下，以免发生漏检。

3.2 通过本试验发现，增菌过程对志贺氏菌的检测准确性影响很大，因为沙门氏菌、大肠埃希氏菌的优势增长，可能对志贺氏菌的增长产生很强的抑制作用，造成后期选择性分离或TSI试验时，挑选不出可疑菌落，造成漏检。因此，志贺氏菌的增菌条件、增菌培养基选择、增菌时间等应严格控制。

3.3 在检测宋内志贺氏菌（D群）时，因宋内志贺氏菌与大肠埃希氏菌、类志贺邻单胞菌等极为相似，生化反应与A、B、C群也有很大区别，极易造成漏检。可用沙门氏菌显色平板和EMB平板进行分离，沙门氏菌显色平板上蓝色菌落而EMB平板上无色菌落则可视为宋内志贺氏菌可疑菌落，再进行生化及血清学鉴定，此方法不易漏检。

3.4 沙门氏菌属和部分志贺氏菌属均能代谢利用甘露醇，因而在GN增菌液中均能快速增殖，要特别注意志贺氏菌属与不产硫化氢的沙门氏菌和变形杆菌的区别。由于都不发酵乳糖或迟缓发酵乳糖，它们在XLD、HE、SS、EMB培养基平板上都有相似的菌落特征，大都为无色半透明菌落，容易漏检或错判。可以选用沙门氏菌显色培养基、志贺氏菌显色培养基结合TSI生化试验来加以鉴别。

3.5 志贺氏菌属没有动力，没有鞭毛抗原，主要是菌体（O）抗原，个别志贺氏菌有K抗原，并且极个别志贺氏菌会发生自凝集反应。某些不活泼的大肠埃希氏菌、A-D菌也能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集反应。志贺氏菌属又分A、B、C、D四个群抗原，因此志贺氏菌属的血清学反应复杂，又有一定的不确定性，可对志贺氏菌血清学鉴定优化如下∶分别选用1.5%琼脂培养物和100℃煮沸20 min浓菌液作玻片凝集试验，同时用生理盐水作对照自凝试验，若均不凝，则可直接判断为阴性。若凝聚，则可按B、D、A、C群的顺序进行群多价血清凝集试验，阳性菌株至少与其中一群多价血清发生凝集。

4 小结

综上所述，选用志贺氏菌增菌液在37℃厌氧条件下培养6 h增菌，再用XLD、EMB培养基等分离培养，以B、D、A、C群的顺序进行群多价血清凝集试验，最后结合全自动微生物鉴定，能显著提高饲料中志贺氏菌检测方法的准确性，有效减少杂菌干扰，降低漏检率。

（参考文献若干篇，刊略，需者可函索）