申贵隽 魏婷 赵婷

（大连大学 环境与化学工程学院，辽宁 大连116622）

0 前言

磷对作物生长发育具有重要影响。磷是作物体内脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）的组成成分。这些有机磷化合物对作物的生长与代谢起重要作用。正常的磷素营养有利于核酸与核蛋白的形成，加速细胞的分裂与增殖，促进营养体的生长，尤其在作物生长早期，充足的磷素营养尤为重要，生长前期作物吸收的磷，可以再利用，参与新生组织的形成与代谢。磷与水稻植株体内糖、氮和脂肪代谢有密切关系；磷参与能量代谢，它在细胞质中迅速酯化形成腺苷一磷酸（AMP）、腺苷二磷酸（ADP）和腺苷三磷酸（ATP）。土壤供磷不足，既影响植物的光合作用和呼吸作用及生物合成过程等，也影响植物细胞分裂、新细胞形成及细胞伸长，使植株瘦小，分枝减少。施磷肥能促进水稻作物的CO同化和蛋白质合成，稻株的生长正常籽粒重量增加，从而提高产量。在作物高产、优质、高效栽培中，磷对养分协调供应，也有不可取代的作用［1］。

土壤中总磷含量的测定方法主要以铋磷钼蓝分光光度法为主［2］，该方法操作简便、分析成本低、显色稳定、选择性好、灵敏度高、干扰少，但仪器携带不方便，一般用于实验室分析。因此，磷含量测定方法的简单化、便捷化且易推广化对监测部门具有重要的现实意义。如今，数码相机具有强大的功能、操作便捷和出色的拍摄效果等优点，在纳米材料的表征、生物学研究、药材的显微鉴定［3－4］、土壤形态分析及考古学等领域得到了广泛的应用。由于数码相机不能分光，使其在分析化学领域应用很少。数码成像是基于CCD电荷耦合器件记录影像，再把CCD器件的电子信号转换成数字信号［5］。基于RGB原理，Maleki利用数码成像建立人工神经网络［6］，把数码相机作为检测器用于酸碱滴定分析，取得了较好的效果。由此可见，数码成像已经被逐渐运用于分析化学研究中。所以，本研究在有效避免光的反射、侧光及投影的情况下利用自然光使标准试样和待测样品成像，再基于RGB原理定量分析土壤中的总磷的含量。此方法简便，快捷，并且用于现场测量。

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

UV－2102PC型紫外可见分光光度计（浙江华南仪器设备有限公司），1XUS 310HS型佳能相机。

钼酸盐、磷酸二氢钾（KH2PO4，郑州派尼化学试剂有限公司），硫酸、氢氧化钠、酚酞和抗坏血酸（广州化学试剂有限公司）。

磷标准储备溶液（100mg／L的磷酸二氢钾）。所用试剂均为分析纯试剂，实验用水为二次去离子水。

1.2 土壤样品的预处理

将土壤样品研磨，用筛孔尺寸为0.250mm的筛子筛取试样，风干之后准确称取样品0.25g（精确至0.000 1g），小心放入坩埚底部，加入无水乙醇3～4滴，润湿样品，在样品上平铺2.0g的氢氧化钠，将干锅放入高温电炉，升温，当温度升至200℃左右，切断电源，暂停15min，然后继续升温至300℃，并保持15min，取出冷却，加入10mL约80℃的水，同时用H2SO4（3mol／L）溶液和去离子水，多次洗坩埚，洗涤液也一并转入容量瓶中，冷却，定容待熔块溶解后，用无磷定量滤纸过滤或离心澄清，定容至100mL，同时做空白实验。

1.3 磷标准溶液的配制

将磷标准储备溶液分别配制成浓度为0.00，31.51，34.84，48.54，53.45，64.39mg／L 的磷标准溶液，分别在6个50mL烧杯中加等量的磷标准溶液，另外再在1个烧杯中加等量的去离子水作为对照实验。

1.4 实验步骤

在以上6个烧杯中分别加入1滴酚酞指示剂，滴加NaOH至刚呈微红色，再滴加H2SO4溶液使微红色刚好褪去，充分混合，用水稀释至刻度。

加入1.0mL抗坏血酸溶液混匀，30s后加2.0mL钼酸盐溶液充分混匀。

室温下放置10min用简单模式直接数码成像，如图1所示。由图1得知溶液颜色随着磷酸二氢钾溶液浓度的增加逐渐变浅。

1.5 Photoshop软件读取RGB值

1）文件——打开——选取实验图片，软件截图如图2所示。

2）选取图片颜色分布比较均匀的地方，点击工具栏最下方的颜色图标，出现如截图3所示。

3）记录图片的RGB值得出表1所示不同浓度下磷酸二氢钾的三原色对照值［7］。

1.6 浓度计算程序编译依据及软件应用

1.6.1 浓度计算程序编译依据

由文献查得RGB与灰度Gray（Gr）之间的通用关系式：Gr＝R×0.3＋G×0.59＋B×0.11［8］。

利用Excel分别将 R（红色），G（绿色），B（蓝色）拟合成与浓度C的关系：

R＝1.12C＋21.1；G＝0.9C＋91.1；

B＝1.09C＋129.2

利用以上公式可得灰度Gray与浓度C之间的关系：

Gr＝0.986C＋73.14

1.6.2 软件应用

将此浓度计算软件安装到手机上，运行并打开窗口［9］。

用Photoshop软件读取实验图片的RGB值，代入浓度计算软件点击确定即可。窗口截图如图4。

图1 不同浓度下溶液颜色的变化Figure 1 Solution color changes with different solution concentrations.

图2 Photoshop打开图片的软件界面Figure 2 Software interface for using Photoshop to open a picture file.

图3 Photoshop读取图片RGB值的软件界面Figure 3 Software interface for using Photoshop to read RGB value of a picture.

图4 浓度计算窗口Figure 4 Concentration calculation window.

图5 样品溶液的颜色变化Figure 5 Color changes of the sample solution.

1.7 试剂包

由于该方法适用于现场快速测定土壤中总磷含量，因此此方法将测定过程需要的药品由试剂包A和试剂包B组成。

试剂包A：①无水乙醇，②氢氧化钠，④去离子水，③硫酸溶液。主要用于土壤样品的预处理。

试剂包B：①酚酞指示剂，②NaOH溶液，③H2SO4溶液，④抗坏血酸，⑤钼酸盐溶液。主要用于土样溶液和标准溶液的显色反应。

使用顺序：先A后B。

2 样品测定

2.1 土壤样品的测定

分别准确吸取两份待测样品溶液2～10mL于两个50mL容量瓶中，用水稀释至总体积的3／5处，分别加1滴酚酞指示剂，再滴加NaOH至刚呈微红色，然后滴加H2SO4溶液使微红色刚好褪去，充分混合，用水稀释至刻度，加入1.0mL抗坏血酸溶液混匀，30s后加2.0mL钼酸盐溶液充分混匀。室温下放置10min用简单模式直接数码成像。成像结果见图5。最后按实验步骤依次读取RGB值、用自编软件直接读取总磷含量值（见表2）。

2.2 样品测定结果与加标回收实验

另取已知含量的样品溶液两份，分别加入磷标准溶液使其浓度达到原样品浓度的二倍，然后按实验方法测定其总磷含量并计算加标回收率（结果见表2）。

2.3 方法精密度与比对实验

用磷标准储备溶液配制成10，20，30，40，50，60，70，80mg／L的磷酸二氢钾标准溶液，显色后分别测得其吸光度。经回归分析得知其相关系数R＝0.98，线性方程为：A＝－0.023 7C＋1.847 6。

表2 土壤中总磷含量测定结果Table 2 Analytical results for the totalphosphorus of soi

再将磷标准储备溶液分别配制成浓度为0.00，31.51，34.84，48.54，53.45mg／L 和 64.39mg／L的磷标准溶液。将上述溶液依次分别取两份，并按照实验步骤加入显色剂。一份应用前面所述的数码比色方法测定该标准溶液的浓度，另一份用分光光度计测定其吸光度并代入线性方程求得浓度的对比测定值，实验结果见表3。两种方法测定结果基本一致。

另取总磷含量为34.84mg／L的标准溶液做10次平行测定，结果表明相对标准偏差为1.2%。

表3 标准储备液浓度的数码比色与分光光度法测定结果Table 3 Comparison of the analytical results for the standard stock solution using digital colorimetric method and spectrophotometry ／（mg·kg－1）

3 结论

手机数码比色法测定土壤中总磷浓度经国家有证标准物质验证，测定准确度能够满足环境样品的测试要求，并且此方法与传统测定方法相比克服了肉眼对颜色的分辨率，极大地提高了方法的灵敏度和精密度，发展了传统的比色分析技术，并且此方法方便快捷，容易操作，成本低，能够进行现场分析，是一种农民自行测定土壤中总磷含量的好方法。

［1］中国农业百科全书总编辑委员会，农业化学卷编辑委员会，中国农业百科全书编辑部编 .中国农业百科全书：农业化学卷［M］.北京：农业出版社，1996：429－430.

［2］孙骏 .铋磷钼蓝分光光度法测定土壤中磷含量［J］.环境监测与预警，2011，3（6）：20－21.

［3］张勉，谢帆，王胜勇 .诃子类药材的数码显微鉴定［J］.华西药学杂志，2005，20（6）：503.

［4］李春艳，申贵隽，李建华 .数码比色法测定环境及生物样品中的氰化物浓度［J］.中国无机分析化学，2012，2（2）：24－26.

［5］杨传孝，孙向英，刘斌，等 .数码成像比色法测定水样中的总磷［J］.分析化学，2007，35（6）：850－853.

［6］Maleki N，Safavi A，Sedaghatpour F.Single－step calibration，prediction and real samples data acquisition for artificial neural network using a CCD camera［J］.Talana，2004，64（4）：830－835.

［7］郑利华，刘旭明.Photoshop中彩色照片转黑白的几种方法与效果比较［J］.桂林航天工业高等专科学校学报，2007，47（03）：45－47.

［8］陈兴峰，刘卫东，乔明，等 .基于FPGA的色彩空间RGB与HSI的相互转化算法［J］.真空电子技术，2008，36（5）：18－21.

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