曲连悦，蔡 爽，姜明燕

(中国医科大学 附属第一医院 药学部，辽宁 沈阳 110001)

人重组蛋白胸腺素B10促进卵巢癌细胞系SKOV3凋亡

曲连悦，蔡 爽，姜明燕*

(中国医科大学 附属第一医院 药学部，辽宁 沈阳 110001)

β族胸腺素由于具有维持细胞骨架的动态平衡，促进血管生成、伤口愈合、心肌修复等多种生物学功能,并与肿瘤发生、转移具有密切关系而倍受关注。本文研究对象胸腺素B10(thymosinβ 10，Tβ10) 定位于胞内，大量文献证实Tβ10与肿瘤的发生发展有关[1-2]，但在不同类型的肿瘤中它的功能还存在争议，Tβ10在肿瘤细胞凋亡中所起的作用也鲜有报道。本实验将在卵巢癌细胞系SKOV3中探索Tβ10对其凋亡的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料:重组人Tβ10蛋白(Abcam公司)；流式双染试剂盒(BD公司)；caspase-3活性检测试剂盒(Haimen公司)；Cell Counting Kit-8® solution(CCK-8)试剂盒(日本同仁公司)；Annexin V-FITC/PI双染试剂盒(KeyGEN公司)；BAX、BCL-2 抗体(Santa Cruz公司)；RNA提取及Realtime PCR(Takara公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：培养SKOV3细胞使用DMEM 培养基含10%灭活小牛血清。37 ℃,5% CO2的条件下培养，每2天换1次液，并用0.25%的胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 细胞活力检测：使用CCK-8 检测细胞的增殖能力。将处于对数增殖期的SKOV3细胞分成4组，其中1组为对照，加入等体积的PBS,另外3组分别加入0.5、1或2 g/L 3个浓度的Tβ10，24 h后按每孔4×103个/100 μL将各组分别接种于96孔培养板中，待其贴壁后每孔加入10 μL CCK-8 继续培养4 h。检测在450 nm 波长下测定各孔吸光度值，以不含细胞的等体积培养基作对照。

1.2.3 细胞凋亡检测:使用Annexin V-FITC/PI双染试剂盒进行细胞凋亡检测。细胞接种于6孔板内，每孔3 mL大约4×105个，实验组加入Tβ10 1 g/L，对照组加入PBS，24 h后收集细胞。流式细胞仪计数1万个细胞，细胞凋亡百分比用CellQuest analysis 软件计算。

1.2.4 Caspase-3活性检测:使用caspase-3活性检测试剂盒。实验组加入Tβ10 1 g/L,对照组加入等体积的PBS,24 h后两组细胞在裂解液中裂解, 然后离心10 min,进行蛋白定量。将每组蛋白取30 μg放入96孔板中与caspase-3显色底物(2 mmol/L)混合，37 ℃孵育2 h。使用酶标仪在405 nm处测定吸光度值。

1.2.5 实时定量PCR:收集细胞提取总RNA，反转录后使用SYBR Green 法进行定量real-time PCR扩增，总体积20 μL。40个循环退火温度60 ℃，30 s。

β-actin作为内参。引物序列见表1。基因相对表达水平计算方式如下ΔCt =Ct 待测基因-Ct 内参基因, ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组，增加倍数用如2-ΔΔCt方法计算。每次实验均做3个重复孔。

表1 Real-time PCR中使用的引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.6 Western blot法检测蛋白表达：收集细胞并加入裂解液充分裂解，4 ℃ 12 000r/min离心30 min,提取上清。使用总蛋白60 μg，SDS-PAGE凝胶电泳、转印到PVDF上；5%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭2 h，分别与抗BCL-2,抗BAX(1∶300),抗β-actin(1∶500), 4 ℃孵育过夜。分别与对应的二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，ECL显色，结果经自动电泳凝胶成像分析仪采集，进行灰度值测定。

2 结果

2.1 加入Tβ10后SK0V3细胞的活力变化:SKOV3细胞内加入3个浓度的Tβ10后，24 h细胞活性明显下降(表2)。

表2 不同浓度Tβ10加入SKOV3后细胞活力的变化

*Plt;0.05,**Plt;0.01compared with the 0 g/L concentration group.

2.2 加入Tβ10后SK0V3细胞凋亡百分比的变化:加入1 g/L的Tβ10后，SK0V3的调亡百分比由5.23%上升至12.34%，Plt;0.01(图1)。

图1 胸腺素β10对SKOV3细胞凋亡的影响Fig 1 Effect of thymosin β10 on the apoptosis of SKOV3 cell

2.3 加入Tβ10后SK0V3细胞内caspase-3活性的变化：加入1 g/L的Tβ10后，SK0V3中caspase-3的活性由100%增强至287%(Plt;0.01)。

2.4 实时定量PCR检测SKOV3细胞中凋亡相关基因mRNA的变化：与凋亡密切相关基因Bcl-2及BAX检测结果显示，加入1 g/L Tβ10后促进凋亡的BAX的mRNA水平上升，而抑制凋亡的Bcl-2的mRNA表达下降(图2)。

*Plt;0.01 compared with control图2 胸腺素β10对SKOV细胞中Bcl-2及Bax mRNA的影响Fig 2 Effect of thymosin β10 on the mRNA level of Bcl-2 and Bax in SKOV3 cell

2.5 蛋白免疫印迹检测SKOV3细胞中凋亡相关基因蛋白的变化：加入1 g/L Tβ10后的SKOV3细胞检测Bcl-2、BAX这两种蛋白的变化显示，BAX蛋白表达灰度值由0.09±0.01上调到0.4±0.16，而Bcl-2表达灰度值由0.63±0.14下降到0.2±0.11(图3)。

图3 胸腺素β10对SKOV3细胞中Bcl-2及Bax蛋白的影响Fig 3 Effect of thymosin β10 on the protein level of Bcl-2 and Bax in SKOV3 cell

3 讨论

Tβ10目前在肿瘤中的作用存在很大争议,一些研究证明它与Tβ4作用相似在肿瘤组织中高表达[3],同时能够促进肿瘤血管生成和肿瘤细胞侵袭转移,抑制肿瘤细胞凋亡。但也有研究证明Tβ10在卵巢癌中表达降低[4]。Tβ10在不同肿瘤中所起的作用及其机制还有待于进一步完善。在本研究中，卵巢癌细胞系SKOV3中加入Tβ10后细胞的凋亡百分比升高， Bcl-2的水平显著降低，而BAX的水平显著增高， Bcl-2/BAX的比率的降低，使更多的细胞发生了凋亡。因此Tβ10可能通过降低Bcl-2/BAX的表达水平促进SKOV3细胞的凋亡。

本研究证实在卵巢癌细胞系中，外源加入Tβ10能有效抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡，这种促凋亡作用可能是通过降低Bcl-2/BAX的比率来实现的。该研究结果拓展了对Tβ10在肿瘤中作用机制的认识，为抗肿瘤药物开发提供了新的方向。

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2013-12-19

2014-03-12

*通信作者(correspondingauthor)：qqllyy447743@163.com

1001-6325(2014)05-0707-02

R 737.3

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