吴小婷， 张 怡， 吴清吟， 汪 颖， 郑宝东

(福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002)

抗性淀粉(resistant starch，RS)是一类在健康者小肠中无法被吸收利用的淀粉［1-2］，但可在结肠中被大肠菌群发酵或部分发酵，具有类似可溶性膳食纤维的生理功能，包括预防胃肠疾病和心血管疾病;降低溃疡性结肠炎和结肠癌的风险;促进细菌生长和矿质元素的吸收，增强疾病抵抗力等［3］.抗性淀粉由于能通过降低血糖指数来减少血浆胰岛素和血糖反应，且具有饱腹感，而被视为控制体重的良好选择.它除拥有未改性淀粉所不具有的生理功能外，具有更好的食用口感.把抗性淀粉添加于食品中，能使食品呈现特殊质地，甚至延长食品货架期［4-5］.近年来，人们对健康的关注，使得对功能性保健食品的要求日趋提高，抗性淀粉也成为人们新的研究对象［6］.根据抗性原理的不同，抗性淀粉可分为5类［7］:即 RS1物理包埋淀粉，其蛋白质与细胞壁的包埋作用是引起抗性的主要原因;RS2抗性淀粉颗粒，包括具有抗性的天然淀粉颗粒和未糊化的淀粉颗粒;RS3回生或结晶淀粉;RS4化学改性淀粉，交联淀粉是其中常见的一种;RS5直链淀粉-脂质复合淀粉，亦称淀粉脂.RS3是淀粉糊经过糊化后，其中的直链淀粉经过低温冷却，结晶形成的难以被淀粉酶酶解的老化淀粉［8］.虽然RS3与RS4都可以通过加工原淀粉大量制备，但RS4的制备过程中添加的化学试剂将会影响食品安全.由于RS3具有营养特性、加工稳定性及食用安全性，其应用前景良好，成为近几年研究的热点［9］.制备RS3方法多样:热液法，物理挤压法，化学酶解法.微波［10］、超高压［11］以及超声波［12-13］亦被应用于RS3制备中.

莲子营养价值高，并含有特殊的药理成分［14-16］，属于药食同源的食物［17］.莲子中的直链淀粉与抗性淀粉的形成有关.压热法制备抗性淀粉是通过高温、高压使淀粉颗粒膨胀破裂，糊化形成淀粉凝胶.在此过程中，无规则状态的直链淀粉(random coil)从颗粒中溶出.在冷却回生过程中，直链淀粉迁移，游离的直链淀粉链通过氢键重新结合形成双螺旋结构(junction zones)，之后进一步折叠盘绕形成结晶(crystallites)，产生抗性.此过程淀粉分子经历了从杂乱无章状态到紧凑有序的结晶结构［18］.研究表明，随着直链淀粉含量的提高，其淀粉糊在低温环境下越容易老化形成抗性淀粉［19］，这为莲子抗性淀粉的制备提供了可靠的理论依据.超声波是一种振动频率高于人耳接收范围的机械波［20］.这种声波在溶液中传播时，能够加速溶剂分子与溶质分子之间的摩擦，切断聚合物分子连接键形成长度较短的分子链.其振动的能量在传播过程中会被聚合物吸收，从而使分子所含的能量提高，这对直链淀粉的重结晶具有积极作用［21-22］.将超声波运用于压热法制备抗性淀粉的研究未见报道.

本文通过湿磨法获得莲子原淀粉，运用超声波对原淀粉进行预处理，并结合压热法制得抗性淀粉.研究的单因素为:淀粉乳浓度、超声波功率、超声波处理时间、压热时间和压热温度.运用正交获得最优工艺参数，为促进莲子淀粉商品化生产提供参考［23］.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜冻莲，绿田(福建)食品有限公司，产自福建建宁;葡萄糖淀粉酶(100000 U/mL)，阿拉丁试剂公司;α-淀粉酶(10000 U/mL)，美国 ANKOM 科技公司;柠檬酸、磷酸氢二钠、乙酸、氢氧化钾、3，5-二硝基水杨酸、苯酚，分析纯，国药集团上海化学试剂有限公司.

1.2 仪器与设备

KQ2200DE型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;MJ-60BM01A型美的榨汁机，广东美的生活电器制造有限公司;101-0ES型数显电热鼓风干燥箱，济南金光仪器设备制造有限公司;DZQ400/2D型单室真空包装机，温州市新达包装机械有限公司;GI54TW型全自动立式高压灭菌锅，南京庚辰科学仪器有限公司;XCD-235H型新飞卧式微冻冷冻箱，河南新飞电器有限公司;Starter 300型便携式pH计，美国奥豪斯(上海)有限公司;THZ-82A型水浴恒温振荡器，江苏荣华仪器制造有限公司;L-530型台式大容量低速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;T6型新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司.

1.3 实验方法

1.3.1 原淀粉提取

以一定质量的新鲜冻莲隔绝空气解冻后，加入2倍质量的蒸馏水置于榨汁机中搅碎成莲子浆，浆液过100目筛纱布，加2倍蒸馏水稀释搅拌后，20～25℃静置沉淀8 h.淀粉完全沉降分层后弃去上澄清液，用蒸馏水冲洗沉淀表面，再次用足量的蒸馏水溶解沉淀，在同样的温度下静置，直至淀粉和水完全分层，弃去上清液.最后用蒸馏水清洗沉淀表面，平铺于托盘中，50℃烘干至淀粉水分含量为11.8%［18］，取出密封保存.

1.3.2 抗性淀粉制备

称取不同质量的莲子淀粉加入蒸馏水配制成不同浓度的淀粉乳溶液，充分搅拌后装入真空包装袋中抽真空包装.将淀粉乳超声波处理后于高压灭菌锅中隔层放置.在高压灭菌锅的作用下，使淀粉糊化.之后取出淀粉糊冷却至室温，在4℃下冷藏12 h，干燥粉碎，过筛后密封储藏备用.

1.3.3 抗性淀粉得率测定［24］

未纯化的莲子抗性淀粉中加入3倍体积的蒸馏水，配制成抗性淀粉溶液.往该溶液中加入适量柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，充分搅拌.移取足量液体α-淀粉酶(10000 U/mL)于溶液中，在温度为90℃的恒温振荡器中作用至使碘液不变蓝，之后自然冷却.将4 mol/L的柠檬酸加入至冷却的溶液中，调节pH值4.2左右后再加入过量液体葡萄糖淀粉酶(100000 U/mL)，在温度为60℃ 的恒温振荡器中作用1 h后，自然冷却.将所得溶液4000 r/min离心12min，缓慢取出离心管，防止抖动.倒出上清液后，以蒸馏水溶解沉淀.再次离心，重复上述过程3次.往沉淀中加入5 mL 2 mol/L KOH溶液，用搅拌器持续搅拌30min，使莲子抗性淀粉完全溶解.碱性溶液中加入1 mol/L的乙酸溶液使pH为4.2左右，加入过量液体葡萄糖淀粉酶(100000 U/mL)，60℃恒温振荡器中作用1 h.之后，溶液在4000 r/min转速下作用10min，收集上层液体，用少量蒸馏水洗涤沉淀.溶解沉淀，再次离心，重复3次.将所有上清液混合，最后定容至100 mL.DNS法［25］测定样品中葡萄糖含量.莲子抗性淀粉得率计算如式(1):

式(1)中，W为莲子淀粉质量，g;c'为样品葡萄糖质量浓度，mg/mL;V为抗性淀粉溶解液体积，mL;N为抗性淀粉溶解液稀释倍数.

1.4 实验设计

1.4.1 单因素实验

影响莲子抗性淀粉得率的主要因素有:莲子淀粉乳浓度、超声波功率、超声波处理时间、压热时间和压热温度.为确定各因素最佳范围，按表1进行单因素实验.

表1 单因素水平设计Tab.1 Factors and levels of single factors

以淀粉乳浓度为单因素实验时，固定超声波功率为210 W，超声波处理时间为25min，压热温度为105℃，压热时间为9min.以超声波功率为单因素实验时，固定莲子淀粉乳浓度为25%，超声波处理时间为25min，压热温度为105℃，压热时间为9min.以超声波处理时间为单因素实验时，固定淀粉乳浓度为25%，超声波功率为210 W，压热温度为105℃，压热时间为9min.以压热时间为单因素实验时，固定淀粉乳浓度为25%，超声波功率为210 W，超声波处理时间为25min，压热温度为105℃.以压热温度为单因素实验时，固定淀粉乳浓度为25%，超声波功率为210 W，超声波处理时间为25min，压热时间为9min.

1.4.2 正交优化试验

单因素实验结果表明，淀粉乳浓度、压热时间、压热温度对得率影响较大.超声波作为前处理，其作用时间的长短直接影响制备的效率.故以以上4个因素进行正交优化，设计方案见表2.

表2 正交试验L9(34)因素水平与编码Tab.2 Factors levels and codes in orthogonal test L9(34)

1.4.3 数据与统计

所有实验平行做3次;以平均值表示试验结果;运用Excel 2013和DPSv 7.05数据处理软件进行数据处理和分析.

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

由吸光度对质量浓度进行回归，求得葡萄糖标准溶液曲线Y=0.4780X+0.0044，相关系数 R2=0.9999，如图1.

图1中，Y为在480 nm波长处测定的吸光度值;X为葡萄糖标准液的质量浓度(mg/mL).

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Glucose standard curve

2.2 单因素实验结果与分析

单因素实验结果见图2.

由图2(a)可知，在淀粉乳浓度低于45%条件下，莲子抗性淀粉的得率随着淀粉乳浓度的提高而增加.在淀粉浓度达到45%时，此时得率达最高.在淀粉乳浓度高于45%条件下，莲子抗性淀粉的得率却随着淀粉乳浓度的升高而减少.实验结果表明:淀粉乳浓度的不同影响着抗性淀粉含量的高低.莲子原淀粉晶体是由直链淀粉和支链淀粉构成的，经过超声波预处理后，原淀粉颗粒破裂，直链淀粉被切割成长度较短的分子链并部分溶出.在糊化时，支链淀粉结构瓦解，直链淀粉从颗粒中溢出.当淀粉乳浓度适宜时，溶出的直链淀粉能较充分地结合，促进回生，有利抗性淀粉形成.当淀粉乳溶液浓度过高时，体系中的水不足以使淀粉颗粒完全膨胀，直链淀粉无法完全从颗粒中释放出来，体系黏度变大，进而限制其相互接近形成重结晶，降低了抗性淀粉的得率;当淀粉乳溶液浓度过低，虽然充足的水分能使直链淀粉完全溢出，但是直链淀粉分子在低温回生过程中，相互接近形成双螺旋结构的概率降低，导致抗性淀粉得率下降［11］.因此，适宜的淀粉乳浓度有利于抗性淀粉的形成.

图2 淀粉乳浓度、超声波功率、超声波处理时间、压热时间以及压热温度对莲子抗性淀粉得率的影响Fig.2 Effects of starch concentration，ultrasonic power，ultrasonic time，autoclaving time，and autoclaving temperature on yield of lotus seed resistant starch

由图2(b)可知，莲子抗性淀粉得率随着超声波功率的增大而提高.在超声波清洗器满功率300 W时莲子抗性淀粉得率达到最高.这是因为高强度超声波能破坏淀粉颗粒.莲子淀粉乳在超声波的作用下，水分子与淀粉分子之间摩擦加快，从而引起淀粉分子C—C键断裂［26］，生成大量较短的C—C分子链.较短的C—C分子链更有利于通过氢键形成双螺旋结构［27］.因此，适当强度的超声作用可提高抗性淀粉得率.

由图2(c)可知，莲子抗性淀粉得率随超声波处理时间的增加其差异并不显著.超声波功率和超声波处理时间共同影响着淀粉的水解程度，但从图2(b)和图2(c)的曲线变化来看，超声波处理时间对莲子抗性淀粉得率的影响小于超声波功率.在抗性淀粉的制备过程中，适宜的超声波处理有助于缩短抗性淀粉的制备时间［28］.

由图2(d)可知，随着压热时间的延长，莲子抗性淀粉得率先增大后变小，最后趋于平稳.在压热时间为9min时莲子抗性淀粉得率达到最高.压热时间为9，12，15min对抗性淀粉得率并无显著差异影响.短时间的压热处理不利于抗性淀粉的形成，然而过长时间的压热处理并没有显著提高莲子抗性淀粉的得率.相关研究显示，压热时间的长短对抗性淀粉的形成有一定影响.在超声波预处理作用下，虽然淀粉颗粒中部分直链淀粉溢出，但支链淀粉中的α-1，6-糖苷键的存在会阻碍直链淀粉相互接近.经过压热处理过程，支链淀粉溶解膨胀，直链淀粉将完全溶出.但当压热时间过短，将导致支链淀粉无法完全糊化，直链淀粉的溢出受到抑制且此时其聚合度较高，分子间斥力较大，分子链之间不容易聚集形成晶体.然而，压热时间太长会导致直链淀粉过度降解，使其长度偏短，分子量偏小.这种被过度降解的淀粉分子，长度偏短、分子量偏小，因而无法通过氢键的作用形成双螺旋结构，从而影响抗性淀粉的形成.可见莲子淀粉的压热时间以9min为宜.

由图2(e)可知，莲子抗性淀粉得率在压热温度为105℃时达到最高，且相对于其他压热温度影响显著.当压热温度处于85～95℃时，只有部分直链淀粉溢出，淀粉只发生部分糊化;当压热温度达95℃以上时，大量的直链淀粉分子从淀粉颗粒中溢出，支链淀粉完全糊化，此时溶液呈凝胶状态.当温度进一步升高至105℃时，此时体系的黏度要比淀粉刚糊化的时候低，这对直链结合形成稳定结晶结构有帮助.而当温度进一步升高时，直链淀粉过度降解，难以形成直链淀粉集聚区.此时晶核无法结合直链淀粉，晶体的进一步增长受到限制，不利于抗性淀粉的形成［29］.

2.3 正交试验结果与分析

根据单因素实验的结果:抗性淀粉得率在超声波低功率时均处于较低水平，当超声波功率达到仪器最高值300 W时，莲子抗性淀粉得率最高.故正交试验时选取淀粉乳浓度(%)、超声波处理时间(min)、压热时间(min)和压热温度(℃)为考察因素，采用L9(34)正交表，进行正交试验设计，得出提取莲子抗性淀粉的最佳工艺参数.每个处理重复3次取平均值，正交试验结果如表3和表4.

表3 L9(34)正交试验结果Tab.3 Results of L9(34)orthogonal text

由表3可知，各因素对超声波-压热法制备的莲子抗性淀粉得率的作用大小为:C(压热时间)＞A(淀粉乳浓度)＞D(压热温度)＞B(超声波处理时间).由正交试验结果得出较佳水平组合为A2B3C3D2.即当超声波功率为300 W时，淀粉乳浓度45%，超声波处理时间55min，压热时间15min，压热温度115℃时，计算得出莲子抗性淀粉理论得率最高可达 57.27%.

由表4方差分析中显著性(P值)可知，压热时间(P=0.02)、淀粉乳浓度(P=0.03)对莲子淀粉得率的作用显著，压热温度(P=0.05)对莲子抗性淀粉得率作用不显著.

表4 正交试验的方差分析Tab.4 Variance analysis of orthogonal test

采用所得优化条件，即淀粉乳浓度45%，超声波功率300 W，超声波处理时间55min，压热时间15min，压热温度115℃，进行验证性实验，得出该条件下莲子抗性淀粉实际得率为56.12%，与理论预测值57.27%相差2.01%.因此通过正交优化后所得的最优工艺条件较为可靠，可在超声波-压热法制备莲子抗性淀粉的过程获得较高的抗性淀粉含量.

3 结论

通过试验及数据分析得到制备莲子抗性淀粉的较优工艺参数:淀粉乳浓度45%，超声波功率300 W，超声波处理时间55min，压热时间15min，压热温度115℃.在此条件下莲子抗性淀粉得率为56.12%.

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