高亭亭，蒋彩虹，罗成刚，杨爱国，程立锐，代帅帅

烟草行业烟草基因资源利用重点实验室，中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101

Beinhart1000-1抗赤星病基因的QTL定位

高亭亭，蒋彩虹，罗成刚，杨爱国，程立锐，代帅帅

烟草行业烟草基因资源利用重点实验室，中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101

为探索Beinhart1000-1的赤星病抗性遗传规律，以抗赤星病品种Beinhart1000-1为母本，感病品种G140为父本，构建F1及F2代群体，筛选与抗性基因紧密连锁的SSR标记，并进行抗性基因的QTL定位。结果表明，Beinhart1000-1的赤星病抗性由显性基因控制。同时利用混合群体分组分析法，从2653对SSR引物中，得到83对在抗感池间表现多态且扩增条带稳定清晰的SSR标记。以F2代群体115个单株为作图群体，利用该83对引物进行扩增，经WinQTLCart2.5分析，构建了83个标记的遗传连锁图谱，获得2个抗赤星病QTL位点，分别位于7号和15号连锁群上。

烟草; Beinhart1000-1；赤星病; SSR; QTL定位

烟草赤星病是严重制约我国烟叶生产的一类真菌病害，该病具有潜育期短，爆发快的特点，在温湿度适宜的条件下，短时间内即可大面积流行，给烟叶生产造成巨大损失[1-2]。雪茄烟品种Beinhart1000-1高抗赤星病，是抗病育种的优良抗源，对其抗性进行深入研究具有重要意义。

近几年来，为了快速有效的选择优良植株，国内外广泛应用了分子标记技术：寻找与优良性状紧密连锁的分子标记，然后利用这些标记去栽培群体中选择优良单株，从而提高育种效率、缩短育种年限。分子标记中的SSR（Simple sequence repeats）标记具有重复稳定性好的特点，但是由于SSR标记引物的开发比较缓慢，限制了其在烟草研究中的应用。直到Bindler等公开发表了高密度的烟草遗传连锁图谱，包括2300多对SSR引物[3-4]，SSR标记在烟草上的应用才有了长足发展。

目前，国内对Beinhart1000-1的赤星病抗性研究还非常有限，其抗性遗传潜力很大。随着分子标记技术的不断发展，对该品种的研究也在不断深入。

本研究旨在筛选与Beinhart1000-1的赤星病抗性基因紧密连锁的SSR标记，分析Beinhart1000-1赤星病抗性遗传规律，将其抗性基因进行QTL定位，研究亲本来源不同时，抗性基因遗传位点的差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料

母本为抗赤星病品种Beinhart1000-1，父本为感病品种G140，两者都由中国农业科学院烟草研究所遗传育种研究中心提供，由它们杂交获得(Beinhart1000-1×G140)F1，自交获得F2代分离群体。

1.1.2 烟草赤星病菌

用于接种鉴定的赤星病菌由中国农业科学院烟草研究所植物保护研究室提供。

在马铃薯琼脂培养基上接种烟草赤星病菌，然后将其在28 ℃恒温培养箱中培养大约两周。当菌丝体基本长满培养基时取出，在培养皿中倒入无菌水，浸泡约5 min后刮下菌丝体，加入蒸馏水，配成孢子浓度约为1xl06/mL的悬浮液[5]，备用。

1.1.3 SSR引物

所用SSR引物来自Bindler[6]公开发表的烟草SSR连锁图及其引物序列，且标记所在连锁群已知。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用超纯水将引物粉末稀释为10 µmol/L的工作浓度备用。

1.2 试验方法

1.2.1 菌液接种方法

试验采用划伤悬滴法接种。抗病对照为Beinhart l000-l，感病对照为G140。在烟叶成熟期，每株烟选取两片底部长势相近的叶片接种，在每片用于接种的叶子的主脉两侧用接种针均匀地划6个十字划伤，在每个伤口处悬滴一滴接种菌液，接种后将接种叶片套上透明塑料袋，以保持温湿度。接种7 d后，划伤周围开始出现侵染症状，接种14 d发病症状明显。接种后20 d时，调查发病情况，计算病情指数。

1.2.2 病情统计标准[5]

单株调查分级标准：0级：全部划伤无侵染；l级：有25%的划伤形成病斑，但不扩展；2级：有50%的划伤形成病斑，且稍有扩展；3级：80%的划伤形成病斑，且有明显扩展；4级：100%的划伤有侵染，且形成很大病斑，被侵染处形成坏死斑。

群体抗性划分标准：免疫：病级数为0级；高抗：病级数为1级；中抗：病级数为2级；中感：病级数为3级；高感：病级数为4级。

其中，0级、1级和2级划分为抗病群体，3级和4级划分为感病群体。

病情指数=[(病级代表值x该级叶片数)/(调查总叶片数/最高级代表)]x100

1.2.3 DNA的提取及抗感池的建立

采用稍加改良的CTAB 法提取烟草总基因组DNA[7]，利用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测所提DNA的质量，-20 ℃保存备用。

抗感池的建立：在抗性鉴定之后，从 F2代分离群体中分别选取10株感病单株和 10 株抗病单株，将其 DNA 分别等量混匀组成抗感池。

1.2.4 PCR扩增反应和电泳检测

PCR 反应体系[8]总体积为10 μL，其中30～50 ng/μL的DNA模板1 μL、5 μmol/L正反向引物各 1 μL，2×Mix 5 μL，H2O 2 μL。所用试剂购自MBI。

PCR 反应在 96 孔ABI Veriti型多梯度PCR仪上运行[9]：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 15 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共 35个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。其中，退火温度根据引物序列不同略作调整。

PCR 反应结束后，取3 μL PCR 产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒电压1000 v 电泳1.5 h左右。用改进的 NaOH银染方法[10]对电泳后的聚丙烯酰胺凝胶进行染色显影。

1.3 数据统计与分析

首先使用MAPMAKER软件包，利用供试F2群体的SSR标记基因型数据，构建遗传连锁图。然后结合遗传连锁图谱和表型鉴定数据，应用WinQTLCart2.5软件进行QTL定位，其中permutation times设为1 000，LOD阈值设定为≥2.5。

2 结果与分析

2.1 供试材料赤星病抗性鉴定结果

抗性鉴定结果表明：Bcinhartl000-l的病情指数为9.7，表现为抗病；G140的病情指数为66，表现为感病；F1代病情指数为38.4，表现为中抗（表1）。据此推测，Beinhartl000-l对赤星病的抗病性是由显性基因控制的。

表1 供试烟草材料接种赤星病菌后发病情况调查表Tab.1 Disease observation of tobacco materials inoculated with the brown spot

2.2 烟草赤星病抗性遗传分析

大田条件下，对F2代分离群体进行赤星病的抗性鉴定。根据上面试验方法中提到的病情划分标准，将其病级划分为 0～4 级 5 个级别，统计结果如图1。由图可知，F2代群体的病情分布情况基本符合正态分布规律，结合往年田间试验观察及Beinhart1000-1的自身抗性表现，预测Beinhart1000-1对赤星病的抗性由多基因控制。

图1 F2群体单株病情分布图Fig.1 The resistance identification of seedling in F2 generation

2.3 抗性基因的SSR标记筛选

以抗感亲本及F1的DNA为模板进行PCR扩增，筛选了分布于24条连锁群上的2 653对SSR引物，共筛选得到184对多态性引物，多态比率为6.9%。采用Michelmore等[11]提出的分离群体分组分析(BSA)法，将筛选到的多态性SSR引物在抗感池间进行PCR 扩增，并将PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳银染显色。从184对SSR引物中挑选出了83对扩增稳定且多态性显著的引物。

图2 引物M653在部分F2分离群体中的扩增效果Fig.2 Polymorphism produced by M653 primer among the partial F2 plants

2.4 赤星病抗性基因的QTL定位分析

应用该83对引物对抗性鉴定完毕的115株F2单株进行PCR扩增，再利用基因型数据构建遗传连锁图谱，如图3所示。共得到18个连锁群，图谱全长1014.70 cm，包含72个标记位点，平均每个连锁群上有4个SSR标记，标记间平均遗传距离为14.09 cm，另外有11个标记未能连锁到该图谱上。

根据构建的遗传图谱，利用复合区间作图法对烟草赤星病的抗性QTL进行定位分析，共检测到两个QTL位点：一个位于7号连锁群上，在标记M122与M935之间，其峰值LOD为3.3688，贡献率为15.9%，加性效应0.0571，暂将其命名为RBS-1，则RBS-1与标记M935间的遗传距离为7.4 cm；另外一个QTL位于15号连锁群上，在标记M524与M653之间，其峰值LOD为3.1358，贡献率为14.4%，加性效应-0.1302，暂将其命名为RBS-2，则RBS-2与标记M653间的遗传距离为9.8 cm。定位分析最终结果如表2。

图3 基于SSR的遗传连锁图谱Fig.3 Genetic linkage map based on SSR markers

表2 QTL定位分析结果Tab.2 Results of QTL analysis

3 讨论

目前种植的高抗赤星病的烟草品种较少，而雪茄烟品种Beinhart1000-1是公认的抗赤星病育种的良好抗源，对其进行深入细致的研究对有效利用该抗源进行抗病品种的选育具有重要意义。

有研究认为Beinhartl000-1的赤星病抗性是由单基因控制的部分显性遗传[12-13]；还有研究认为Beinhartl000-1的赤星病抗性都是由多基因控制的[14-15]；郭永峰等[16-17]则认为Beinhartl000-1的赤星病抗性为显性多基因控制的水平抗性。本研究推测Beinhart1000-1对赤星病的抗性由显性多基因控制，与前人的研究有一定的差异[5-6,12-18]，这可能是由于亲本材料的选择、抗性鉴定株系、病菌接种方法和实验环境等的不同导致的实验结果出现差异。

蒋彩虹等[18]曾在2007年筛选到一个与Beinhartl000-1的赤星病抗性基因相连锁的SRAP标记，遗传距离为16.0 cm。本研究应用的是SSR引物，来自2011年Bindler[6]公开发表的高密度连锁图谱，覆盖整个烟草基因组，要比蒋彩虹等人所用的SRAP引物稳定重复性好，且数量更大，密度也更高。此外，本实验是利用WinQTLCart2.5软件对实验所得基因型数据与表型数据进行分析，结果更为可靠。目前针对赤星病抗性基因的QTL定位研究较少，本研究利用烟草高密度遗传连锁图谱定位到两个QTL，分别位于7号和15号连锁群上，与目的基因间的遗传距离分别为7.4 cm和9.8 cm，这进一步表明Beinhartl000-1对赤星病的抗病性由多基因调控，而且这两个QTL分别与标记M935和M653连锁，在分子标记辅助育种中具有一定的应用价值。

4 结论

利用赤星病抗、感亲本筛选得到的多态SSR引物，对F2群体单株进行扩增，找到两个与赤星病抗性基因紧密连锁的QTL：其中一个存在于7号连锁群上，与标记M935间的遗传距离为7.4 cm，贡献率为15.9 %；另外一个位于15号连锁群上，与标记M653间的遗传距离为9.8 cm，贡献率为14.4 %。并推测Beinhart1000-1对赤星病的抗病性由显性多基因控制。

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[18]蒋彩虹.烟草赤星病抗性分子标记筛选[D].中国农业科学院烟草研究所2007年硕士毕业论文.

Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to brown spot in tobacco line Beinhart1000-1

GAO Tingting,JIANG Caihong,LUO Chenggang,YANG Aiguo,CHENG Lirui,DAI Shuaishuai
Key Laboratory for Tobacco Gene Resources,Tobacco Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Qingdao 266101,Shandong，China

F1and F2populations were constructed from a cross between Beinhart1000-1 and susceptible variety G140 to study the genetic basis of resistance to brown spot in tobacco cigar line,Beinhart1000-1,and to identify genomic locations contributing to resistance.Inheritance of resistance to brown spot was analyzed in F1and F2populations.Results shown that resistance to brown spot in Beinhart1000-1 was controlled by dominance genes.A population of 115 F2was further used for QTL mapping with 83 SSR markers.Two QTLs,RBS-1 and RBS-2,were discovered on No.7 and 15 genetic linkage groups through composite interval mapping method.The major QTL,RSB-1,was flanked by marker M935 with genetic distance of 7.4 cm and accounted for 15.89% of phenotypic variance.Other major QTL,RBS-2,was flanked by marker M653 with genetic distance of 9.8 cm and accounted for 14.42% of phenotypic variance.These results could facilitate our understanding of inheritance of resistance to brown spot in tobacco by marker-assisted selection.

tobacco; Beinhart1000-1; tobacco brown spot; SSR; QTL analysis

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.02.018

S47; Q78 文献标志码： A 文章编号：1004-5708(2014)02-0104-04

国家烟草专卖局项目(110201002002)；四川省烟草公司科技项目（201101004）

高亭亭（1987—），硕士，主要从事作物遗传育种研究，Email：gaotingting111@163.com

蒋彩虹（1972—），助理研究员，主要从事烟草遗传育种研究，Email：jiangcaihong@caas.cn

2013-07-05