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四环素调控HSV-tk基因在HeLa细胞内表达及抗肿瘤作用

2014-11-24杜珍武马青山张桂珍

中国实验诊断学 2014年9期
关键词:强力霉素质粒

王 茜,杜珍武,马青山,张桂珍*

(1.吉林大学中日联谊医院 肾病内科,吉林 长春130033;2.吉林大学第二医院 中心研究室,吉林 长春130041;

3.吉林大学第一临床学院 儿科,吉林 长春130031)

单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因为肿瘤治疗常用的自杀基因之一,其可将细胞内无毒的前体药物无氧鸟苷(GCV)转变成有毒性的药物,进而杀伤肿瘤细胞[1,2]。研究表明此类自杀基因在体内的过量表达,可损伤机体组织器官,因此调控该基因在体内的表达水平十分重要[3-5]。

四环素基因表达调控系统为较常用的基因表达调控系统[6,7],本研究拟在构建四环素调控 HSV-tk基因表达系统的基础上[8,9],探讨应用四环素调控HSV-tk基因在HeLa细胞内表达及其抗肿瘤作用,为HSV-tk基因可调控性治疗肿瘤研究奠定实验基础。

1 材料与方法1.1 主要材料

pcDNA6/TR 质粒载体 、pcDNA3.1(+)质粒载体、pcDNA3.1-TetO2-TKI质粒载体(含四环素反应元件与HSV-tk基因)及HeLa细胞株由本院中心实验室提供;胎牛血清;DMEM培养基(高糖);Trizol试剂;RT-PCR试剂盒;GCV、MTT、G418、强力霉素、杀稻瘟素;Attractene transfection reagent转染试剂盒;

1.2 方法

HeLa细胞培养、基因转染和基因表达检测、强力霉素调控HSV-tk基因杀伤HeLa细胞,操作按参考文献[8,9]进行。

2 结果

2.1 RT-PCR检测TR基因在HeLa细胞内表达结果

RT-PCR检测结果表明,未转染pcDNA6/TR质粒及转染质粒pcDNA3.1的HeLa细胞未检测到TR基因表达,而稳定转染pcDNA6/TR质粒的HeLa-TR细胞检测到TR基因的表达(见图1)。

2.2 RT-PCR检测强力霉素调控 HSV-tk基因在HeLa细胞内表达结果

稳定转染 TR 和 HSV-tk的 HeLa-TR-TetO2-TKI细胞,经过不同浓度的强力霉素作用48h后,其HSV-tk基因表达的RT-PCR结果显示:随着强力霉素浓度的增大,基因表达的量增加。强力霉素浓度4μg/ml时与 HeLa-TetO2-TKI细胞内 HSV-tk表达水平相当,说明此浓度强力霉素调控基因的表达水平达到了高峰(见图2)。

2.3 Dox调控 HeLa-TR-TetO2-TKI细胞对 GCV的敏感性

将 Dox(4μg/ml)分别加入 HeLa-TR-TetO2-TKI细胞及 HeLa-TetO2-TKI细胞,48h后给予不同浓度的GCV,72h后用 MTT法测定细胞存活率,判定GCV对各组细胞杀伤的敏感性。结果显示:未加Dox时,HeLa-TR-TetO2-TKI细胞对各浓度GCV的细胞杀伤不敏感,而加入Dox后,该细胞对各浓度GCV的细胞杀伤敏感,其50%生存率时GCV浓度为10μg/ml;无论Dox是否存在,HeLa-TetO2-TKI细胞对GCV的细胞杀伤均敏感,其50%生存率时GCV浓度为5μg/ml左右,见图3。

3 讨论

图1 RT-PCR检测TR基因在HeLa细胞内表达

图2 强力霉素调控 HeLa-TR-TetO2-TKI细胞内HSV-tk基因表达的RT-PCR电泳图

图3 Dox调控 HeLa-TR-TetO2-TKI细胞对GCV的敏感性

四环素调控的基因表达系统是利用大肠杆菌Tn10特异的四环素抗性操纵子原理建立的基因表达调控系统,属于负调控作用方式[10,11],由两部分组成:调控部分,表达四环素调控的阻遏蛋白;操纵部分,由四环素反应元件及目的基因组成。基本调控过程如下:调控部分表达的阻遏蛋白TetR和操纵部分的四环素反应元件结合后,抑制了目的基因表达;而加入四环素后,四环素与TetR结合,导致TetR与四环素反应元件脱离,目的基因得以表达。本研究根据上述四环素调控基因表达的原理,应用双载体系统以及四环素类似物强力霉素调控HSV-tk基因在HeLa细胞内表达。实验结果表明:稳定转染四环素阻遏蛋白基因以及四环素反应元件及HSV-tk基因的HeLa细胞,未给予四环素类似物时,用RT-PCR方法检测 HSV-tk基因无表达;给予四环素类似物后,随着药物浓度的增大,HSV-tk基因表达升高。说明四环素可通过该双载体系统,有效地在体外调控HSV-tk基因在HeLa细胞内表达,同时调控了HSV-tk/GCV系统对HeLa细胞的杀伤作用。本研究应用四环素基因表达系统成功地调控了HSV-tk基因在HeLa细胞表达及其肿瘤杀伤功能,为探讨自杀基因杀伤肿瘤的可调控性提供理论基础。

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