周谊芬，董玉林

（南通大学医学院人体解剖学系，江苏226001）

骨髓基质细胞（marrow stromal cells,MSCs）是一种广泛存在于骨髓组织中而非造血的实质干细胞[1-2]。目前研究结果显示，在一定条件下，啮齿类MSCs能够向神经元、心肌细胞和其它类型的细胞分化[3]，被认为是最有临床应用前景的干细胞来源之一[4]。本实验对SD大鼠的MSCs进行了体外分离培养，为进一步研究MSCs的分化潜能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）试验动物：SD普通大鼠4只，清洁级，体重为225～275g，雌雄不拘，由南通大学实验动物中心提供。（2）试剂：IMDM培养基及胎牛血清FBS（GIBCO 公司）。

1.2 方法 （1）MSCs分离、纯化、扩增：取SD普通大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)，麻醉后，75%乙醇浸泡30 min，移至超净工作台上，剔除大鼠两侧的双下肢毛发，2%碘酊消毒，75%乙醇脱碘2次。严格无菌操作下解剖并取大鼠两侧的双下肢，剪除软组织，分离股骨。除去股骨的骨骺段，暴露两端的骨髓腔，用含10%FBS的IMDM完全培养液反复冲洗骨髓腔。收集冲洗液于无菌离心管中，得到细胞悬液，室温下1 000 r/min离心5 min。离心后离心管内的细胞悬液分层，倒掉上清液，加入含10%FBS的IMDM完全培养液重悬细胞，充分吹打形成单细胞悬液。接种于25 mL培养瓶中，置于37℃、5%的CO2恒温培养箱，用全骨髓培养法培养MSCs。48 h后全部更换新鲜培养液，去除未贴壁细胞，继续培养。每隔3～4 d更换新鲜培养液。待贴壁细胞达到80%以上时，以0.25%胰蛋白酶消化，1∶1传代培养。（2）MSC的传代培养：待原代培养的细胞达到80%以上时，进行传代培养。弃去培养瓶中的培养液，DHank液漂洗细胞3次，用0.25%胰蛋白酶均匀覆盖细胞表面，37℃、5%的CO2恒温培养箱放置1～3min。倒置显微镜下密切观察细胞的形态变化，当培养瓶内的细胞开始皱缩成球形。当开始悬浮时，立即加含10%FBS的IMDM完全培养液终止消化。并用吸管轻轻地反复吹打，使瓶壁上的细胞脱落，形成细胞悬液，计数。调整细胞浓度为1.6×105/mL，接种于24孔板，每孔500 μL。待贴壁细胞生长融合达50%～60%时，用PBS轻轻漂洗3次后，用4%多聚甲醛固定1 h，然后再用PBS轻轻漂洗3次。（3）体外培养MSCs的显微镜观察：倒置荧光显微镜下观察MSCs的生长情况和形态特征，并拍照。

2 结 果

原代MSCs接种后24 h内，细胞开始贴壁生长增殖。48 h后全部更换新鲜培养液，去除未贴壁细胞，继续培养。每隔3～4 d更换新鲜培养液，待贴壁细胞达到80%以上时，以0.25%胰蛋白酶消化，1∶1传代培养。倒置相差显微镜观察发现，接种后24 h内细胞开始贴壁，贴壁细胞呈梭形或扁平形（图1A）。48 h后贴壁细胞沿培养瓶壁伸展开，圆形，折光性强，细胞壁完整，胞核隐约可见，胞质丰富（图1B）。传至第5代的MSCs纯度高，增殖能力旺盛，呈梭形或纺锤形的细胞，呈漩涡状、菊花状排列生长（图1C、D）。

图1 MSCs体外培养的形态特点

3 讨 论

目前对人、兔、猴、大鼠等不同种属的MSCs进行培养显示[5]，在研究过程中其取材部位及方式等各有不同。在本实验中我们选用了来源丰富、取材方便[6]的SD清洁大鼠作为实验对象，腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，取大鼠双下肢股骨。用含10%FBS的IMDM完全培养液对骨髓腔进行冲洗，以获得骨髓组织，此操作方法对骨髓中的细胞成分损伤小。

常用于分离MSCs的方法有4种[7]：密度梯度离心法、贴壁筛选法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠法。密度梯度离心法是根据骨髓中各种细胞成分比重的不同，用Percoll分离液将MSCs分离出来。贴壁筛选法主要是根据MSCs的高度粘附特性，在培养过程中其可以紧密地粘附培养瓶壁生长。培养48 h内更换培养液去除不能贴壁的细胞，纯化培养的MSCs。过程操作简单，MSCs增殖快，在短期内可获得较多的MSCs，但所得MSCs纯度不高。流式细胞仪分离法是根据MSCs的胞体小和细胞无颗粒来进行细胞分离的，对细胞活性影响较大，所获得的细胞培养24 h后易死亡。免疫磁珠法可以能得到纯度较高的MSCs，但在实验中，所需要的试剂和仪器都比较昂贵，不宜于广泛使用。因此，本实验采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法，对分离的MSCs进行体外培养，所得细胞增殖旺盛，活力强，随着培养传代的不同，细胞的形态不同。在倒置显微镜下观察90%以上的MSCs形态呈梭形或纺锤形的细胞，呈漩涡状、菊花状排列生长。

[1]刘巧云,易黎.骨髓基质细胞分离培养、体外向神经细胞诱导分化及其在中枢神经系统疾病中的研究进展［J］.神经损伤与功能重建,2010,5(2):139-142,146.

[2]Li Y,Chopp M.Marrow stromal cell transplantation in stroke and traumatic brain injury［J］.Neurosci Lett,2009,456(3):120-123.

[3]Sauerzweig S,Munsch T,Lessmann V,et al.A population of serum deprivation-induced bone marrow stem cells (SDBMSC)expresses marker typical for embryonic and neural stem cells［J］.Exp Cell Res,2009,315(1):50-66.

[4]边颖,何志义.骨髓基质细胞对大鼠缺血性脑梗死神经功能的影响［J］.中国老年学杂志,2010,30(23):3529-3530.

[5]Cornet F,Broux O,Anselme K,et al.Effect of dexamethasone on moesin gene expression in rabbit bone marrow stromal cells［J］.Mol Cell Biochem,2004,265(1/2):79-83.

[6]Parr AM,Tator CH,Keating A.Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the repair of central nervous system injury［J］.Bone Marrow Transplant,2007,40(7):609-619.

[7]Gurevich O,Vexler A,Marx G,et al.Fibrin microbeads for isolating and growing bone marrow-derived progenitor cells capable of forming bone tissue［J］.Tissue Eng,2002,8(4):661-672.