杨珊珊，贾晓民，赵 杰，陈 忱

(徐州医学院第二附属医院呼吸科，徐州 221006;*通讯作者，E-mail:13805206090@163.com)

肺纤维化(pulmonary fibrosis)是一种渐进性的肺部疾病，其病理改变主要以成纤维细胞灶的存在，成纤维细胞数目增多较显著，肺纤维化的预后较差，一经诊断其中位生存时间仅3－4年［1］。百草枯(parquat，PQ)又名克芜踪，是一种剧毒的农药，我国百草枯的用量很大。百草枯可经皮肤、消化道及呼吸道等吸收，在临床上口服百草枯死亡率极高，仅极少数病患得以幸存［2］。因此，本研究组拟用百草枯建立小鼠肺纤维化模型，以便于研究其发病机制及药物学反应等，为临床上找出有效的救治方法提供可能。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级KM小鼠、ICR小鼠及C57BL/6J小鼠各36只，均为雄性，6－8周龄，体重(25±3)g，购于徐州医学院实验动物中心，饲养于清洁环境中。

1.2 主要试剂及仪器

98%百草枯粉剂(PQ)(粉剂，1 g装，购自上海农药研究所)，Masson染色试剂盒及羟脯氨酸检测试剂盒(南京建成生物科技有限公司)，OLYPUMS显微镜等。

1.3 方法

将三个品系小鼠按照随机数字表法分为模型组及对照组。其中模型组又分为10 mg/kg组及20 mg/kg组(n=12)。模型组小鼠按体重10 mg/kg及20 mg/kg称取准确剂量药物后溶于0.5 ml生理盐水中，后小鼠腹腔内注射给药;对照组给予0.5 ml生理盐水腹腔内注入。

观察并记录小鼠的行为学及体重等的变化，死亡小鼠不纳入统计。存活动物均于用药后28 d采用腹主动脉放血法处死，取出肺组织，PBS冲洗后用滤纸吸取肺组织表面水分，取部分左肺组织于4%中性甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色及Masson染色观察肺组织胶原纤维沉积状况。碱水解法测定剩余左肺组织羟脯氨酸含量。

1.4 肺组织羟脯氨酸测定

严格按照试剂盒说明书操作，采用碱水解法测定羟脯氨酸含量(HYP)［3］。

1.5 肺泡炎症及肺纤维化程度的判断

在光学显镜微下观察肺组织的病理变化，并根据Szapiel等［4］提出肺泡炎和肺纤维化的分级法进行评分(见表1)。

表1 肺泡炎及肺纤维化评分表Table 1 The score of alveolitis and pulmonary fibrosis

1.6 统计学分析

应用SPSS16.0统计软件进行数据处理和分析，所有检测数据均以±s表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析(One－Way ANOVA)，进行方差齐性检验，方差齐采用LSD法进行组间比较，方差不齐采用Welch法和Brown－Forsythe法进行校正，以α=0.05为检验水准，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

3个品系的对照组小鼠均表现为体重增加，被毛有光泽，精神状态良好，饮食及饮水正常。

KM小鼠模型组:10 mg/kg组用药后即出现精神不振，活动度下降等现象，但在用药后2 d即恢复正常;20 mg/kg组用药后小鼠出现全身抖动，眯眼，眼中含泪，并且活动度明显下降，后肢行走不稳，呈蹒跚步态，易歪倒。小鼠进食及进水量明显减少，第3天开始即出现老鼠死亡，死亡时小鼠全身抽搐，歪倒，前爪抱起，后肢伸直，张嘴呼吸。

ICR小鼠模型组:10 mg/kg组用药后未出现明显的行为学异常。20mg/kg组小鼠均出现活动度下降，精神萎靡，全身抖动及眯眼等现象，且小鼠均有一定程度的体重下降，进食进水量减少等。用药后当天下午开始出现老鼠死亡现象且全身抖动等症状，严重的小鼠3 d内全部死亡。

C57BL/6J小鼠模型组:10 mg/kg组用药后前3 d均无异常表现，其中2只老鼠从第9天起开始出现明显的体重下降，精神萎靡等现象，其中一只老鼠当天死亡，另一只老鼠体重继续下降至第13天时体重开始回升，并逐渐恢复至正常水平。20mg/kg组小鼠从第4天起开始出现拱背，眯眼，体重下降及活动度下降等现象，出现此现象的老鼠均于2 d内死亡。

2.2 小鼠存活例数

三个品系对照组均未见小鼠死亡。KM小鼠及ICR小鼠10 mg/kg组未出现小鼠死亡，而C57BL/6J小鼠10 mg/kg组自第9天开始出现小鼠死亡，约从第14天起状态稳定，未再有死亡现象出现;三个品系20 mg/kg组均有小鼠死亡，ICR小鼠及C57BL/6J小鼠在用药后4－7 d内死亡较多，后趋于稳定。

2.3 小鼠体重变化趋势

C57BL/6J小鼠自建模后当日即出现体重下降，约14 d时体重降至最低后又缓慢回升，但仍不能恢复至正常水平。ICR小鼠体重自建模后即开始下降，但体重下降不明显，一直在正常范围内波动。KM小鼠体重在7 d内略有下降，后逐渐上升，且体重增加明显高于原水平(图1)。

表2 各组小鼠存活只数 (只)Table 2 The number of survival mice in model group of three strains (cases)

图1 三个品系小鼠模型组的体重变化曲线Figure 1 The changes of body weight in three model groups

图2 各组小鼠肺组织病理学变化 (HE，×400)Figure 2 Morphology of lung tissue in three strains of mice after treament under a microscope by HE staining (×400)

图3 各组小鼠肺组织胶原纤维改变 (Masson，×400)Figure 3 The changes of collagen in lung tissue in three strains of mice after treament under a microscope by Masson staining(×400)

2.4 小鼠肺组织羟脯氨酸含量的变化

三个品系小鼠模型组羟脯氨酸含量均高于对照组(P＜0.01)，且C57BL/6J小鼠模型组羟脯氨酸含量最高(P＜0.01)，ICR及KM小鼠模型组间羟脯氨酸差异无统计学意义(见表3)。

表3 各组小鼠羟脯氨酸含量(±s，n=8)Table 3 The content of hydroxyproline in three strains of mice(±s，n=8)

表3 各组小鼠羟脯氨酸含量(±s，n=8)Table 3 The content of hydroxyproline in three strains of mice(±s，n=8)

与对照组相比，*P＜0.01;与 10 mg/kg组相比，#P＜0.01;与KM小鼠及ICR小鼠比，☆P＜0.01

组20 mg/kg组 24.56±0.55* 24.32±0.42*# 28.87±0.20＊☆

2.5 小鼠肺组织的病理改变及评分

HE染色结果显示:三个品系小鼠对照组肺泡结构基本正常，KM模型组小鼠肺组织仅见肺泡腔变形，炎症细胞浸润，未见明显胶原纤维聚集;ICR模型组小鼠肺组织可见肺泡变形严重，但肺泡腔结构仍然存在，未见片状胶原纤维;而C57BL/6J 10 mg/kg组小鼠可见粉红色的胶原纤维，20 mg/kg组可见片状的胶原纤维细胞，肺泡腔结构消失(图2，见第547页)。Masson染色结果可见(蓝色区域为胶原纤维):对照组仅于气管或血管周围极少量纤维蓝染，KM模型组可见气管旁少许胶原纤维沉积;ICR模型组可见肺泡间隔少许胶原纤维沉积，蓝染区域较KM小鼠稍有增加;C57模型组可见广泛的蓝染区域，肺泡腔结构消失(图3，见第547页)。

三个品系小鼠，只有C57BL/6J小鼠20 mg/kg组肺纤维化评分与对照组比较有统计学差异(P＜0.05，见表4)。

表4 不同品系小鼠百草枯肺纤维化评分表(n=8，±s)Table 4 The score of pulmonary fibrosis in the three strains of mice(n=8，±s)

表4 不同品系小鼠百草枯肺纤维化评分表(n=8，±s)Table 4 The score of pulmonary fibrosis in the three strains of mice(n=8，±s)

与对照组相比，#P＜0.05

ICR小鼠对照组 8 0 0 0 0.00±0.00 10 mg/kg组 7 1 0 0 0.125±0.35 20 mg/kg组 5 2 1 0 0.50±0.76 C57BL/6J小鼠对照组 8 0 0 0 0.00±0.00 10 mg/kg组 6 1 1 0 0.38±0.74 20 mg/kg 组 3 3 1 1 1.0±0.74#

3 讨论

我国是农业大国，百草枯作为除草剂在我国的用量极大，因而每年都有较多的百草枯中毒病例出现，百草枯中毒后早期易出现急性肺损伤及多器官功能衰竭，即使早期幸存，患者在数周内即会发生严重的肺间质纤维化，最终死亡［5］。百草枯中毒后死亡率极高，目前我国仍鲜有百草枯中毒后存活病例的报道，其中后期的肺间质纤维化是导致死亡的重要原因，目前对肺间质纤维化的治疗仍处于研究阶段［6－8］，因此本实验建立百草枯小鼠的肺纤维化模型，为临床研究百草枯中毒提供成熟的模型。

本研究通过对不同品系的小鼠一次性腹腔内注射百草枯制作肺纤维化模型。有文献报道，不同给药途径给予小鼠百草枯均可诱导动物纤维化模型的形成［9－11］。早期研究显示，百草枯小鼠多在建模后3－5 d内死亡，20 mg/kg ICR小鼠全身抖动、走路蹒跚及进食量下降明显者在3 d内均死亡。但KM及C57BL/6J小鼠在3－7 d内死亡，与报道相符［12］。

百草枯可以导致肺泡上皮变性，细胞基底膜局灶性破坏，肺泡腔间质细胞增生，细胞内纤维变性，胶原沉积。通过Masson胶原染色即可分辨出胶原沉积范围及肺间质纤维化的程度。本实验结果显示，在相同剂量的百草枯作用下，肺纤维化程度在C57BL/6J小鼠模型组中相对较重且广泛，但症状出现较迟缓;而KM及ICR小鼠纤维化程度较轻，KM小鼠最轻，且死亡率低于ICR及C57BL/6J小鼠。

羟脯氨酸是胶原纤维中所独有的一种氨基酸，在其他蛋白中其含量甚微，羟脯氨酸含量是反应胶原蛋白变化的敏感指标，测定肺组织羟脯氨酸含量即可反映出肺纤维化的程度［13］。本实验结果显示各模型组的羟脯氨酸含量均高于对照组，其中以C57BL/6J 20 mg/kg组含量最高，表明C57BL/6J小鼠20 mg/kg组其纤维化程度最重，但仍未达到弥漫性分布的纤维化水平。

KM小鼠抗病力和适应力很强，繁殖率和成活率极高，其广泛应用于药理学、毒理学等领域的研究及药品、生物制品的生产与检定。ICR小鼠的外周血及骨髓细胞具有较好的稳定性，是良好的血液学和免疫药物试验，复制病理模型较常用的实验动物。C57BL/6J小鼠对放射有抵抗力，对结核杆菌敏感，对鼠痘病毒有一定的抵抗力，对百日咳易感因子敏感，嗜酒精性高，是研究肿瘤学、遗传学的常用品系。三种小鼠均可复制出肺纤维化小鼠模型，但C57BL/6J小鼠对百草枯更加敏感［9，14］，因此主要应用此鼠建立百草枯肺损伤模型。本研究结果显示C57BL/6J小鼠的羟脯氨酸含量最高，病理改变最重，说明C57BL/6J小鼠与其余两系小鼠相比更容易复制出肺纤维化模型，但是小鼠的死亡率仍较高。因此应用百草枯一次性腹腔内注射建立肺纤维化模型的剂量尚待进一步的研究，既要保证建模的成功，又要最大程度地减少死亡率。

本研究结果显示，KM及ICR小鼠均未能成功建立百草枯肺纤维化模型，仅C57BL/6J小鼠部分区域出现肺纤维化，因此C57BL/6J小鼠更适宜建立肺纤维化模型。

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