唐 琳，李 佳，戴慧蓉，李 莉

(上海交通大学附属第一人民医院，上海200080)

过敏性疾病的患病率在过去的20年中明显增加，尤以儿童更为明显［1］。I型超敏反应是由过敏原与其特异性免疫球蛋白E(Immunoglobulin E，IgE)结合，激活肥大细胞而引发的，IgE是重要的介导物质，血清IgE水平是过敏原诊断、疾病严重程度监测和疗效观察的重要指标。IgE的合成是通过B细胞类别转换重组完成的，而活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶(activation-induced cydine deaminase，AID)是类别转换重组的关键酶［2］。最近，有研究表明，编码AID的基因AICDA的变异即AICDAD的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与过敏性疾病及血清IgE水平明显相关［3］，新生儿脐血IgE水平与儿童过敏性疾病的发生相关性的研究也陆续有报道［4-5］。过敏与遗传相关、受环境等多因素影响的疾病，如果能够寻找到关键基因，明确过敏性疾病的遗传特性，对于过敏的预测、预防和个体化关怀与治疗无疑具有重要研究价值。为更好地探讨过敏性疾病的遗传相关因素，需要排除接触外界物质，包括过敏原等众多后天影响因素，我们选择了脐血为研究对象。根据相关文献报道脐血IgE水平受母亲的影响远远大于父亲［6-7］。因此，本研究选取新生儿脐血为研究对象，着重分析AICDA基因多态性与新生儿脐血IgE的水平的相关性，以期探寻儿童过敏性疾病的易感基因。

材料和方法

一、研究对象

2012年10月至2013年3月，上海国际和平妇幼保健院和上海市第一人民医院收治的足月产妇，按照有无过敏史分为2组(过敏性疾病为哮喘、荨麻疹、过敏性鼻炎或皮炎;常见的过敏原为屋尘螨、动物毛发、金属、海鲜或花粉)，其中无过敏史产妇97例，有过敏史产妇70例。所有入组者均签署知情同意书，并填写调查问卷。

二、方法

1.脐血采集 自然产产妇分娩时采集，于脐带结扎后留取近胎盘端的脐血，乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝，立刻在4℃离心机上4 250×g离心6 min，分离血浆和血细胞，－80℃冰箱保存备检。

2.脐血基因组DNA抽提 采用Axy Prep全基因组DNA小量试剂盒提取脐血基因组DNA，溶于TE缓冲液，置－80℃保存待用。

3.引物设计与合成 根据Genebank公布的AICDA基因序列，设计3个位点引物各1对，rs2518144上游引物5'-TGG ACT TTG GTT ATC TTC GC-3'，下游引物5'-GCA CTC ACA GTT GAC CAT TA-3';rs2028373上游引物5'-CTG CTG GAA TAC TTT TGT AG-3'，下游引物 5'-ACT GAA TTT TCA TGC AGC CC-3';rs11046349上游引物5'-CTC TAA GAA AGT GAGAGT T-3';下游引物5'-ATC TCT GCT GAA GAC AGT GG-3'。PCR 引物和LDR探针由Invitrogene生物公司合成。

4.多态性位点基因型检测 采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术和高温连接酶反应(ligase detection reaction，LDR)方法检测样本DNA序列。多重PCR反应体系为20 μL，反应循环参数为95℃预变性2 min，94℃变性30 s，50 ℃退火 90 s，65 ℃ 延伸 1 min，共循环35次，最后65℃延伸10 min。3%的琼脂糖凝胶电泳检测，观察PCR产物的效果，确定其作为模板在LDR反应中加入的量。LDR反应体系为10 μL，95 ℃预变性2 min，94 ℃变性14 s，50 ℃退火25 s，共30次循环。产物经应用生物系统公司ABI 3730测序仪(美国 AppliedBiosystems公司)测序，结果运用Genemapper进行数据分析。

5.脐血总IgE的测定 采用电化学发光免疫分析法(ECLIA)，经 Roche Cobas 6000仪器(Roche公司，美国)检测。

三、统计学方法

把有无过敏史的产妇分成2组，组间AICDA基因型频率与等位基因频率的比较用χ2检验，各位点基因型对血浆总IgE的影响采用方差分析;以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、AICDA基因多态性与产妇过敏史的相关性

经χ2检验，在无过敏史组和有过敏史组rs2518144，rs2028373，rs11046349 位点基因型及等位基因位点频率分布符合Handy-Weinberg平衡定律，2组均发现各种基因型。rs2518144位点3组基因型(AA/AG/GG)及rs11046349位点3组基因型(TT/TG/GG)分布频率及等位基因频率在无过敏史组和有过敏史组产妇间差异无统计学意义(P均＞0.05)，见表1、2。rs2028373位点3 组基因型(AA/AG/GG)及等位基因分布频率与对照组相比有明显差异(P值分别为0.02和0.006)，见表3。

表1 按产妇有无过敏史比较新生儿脐血rs2518144位点基因型与等位基因频率分布 ［例(%)］

表2 按产妇有无过敏史比较新生儿脐血rs11046349位点基因型与等位基因频率频率分布 ［例(%)］

表3 按产妇有无过敏史比较新生儿脐血rs2028373位点基因型与等位基因频率分布 ［例(%)］

二、AICDA基因多态性与新生儿脐血IgE水平的相关性

AICDA rs2518144，rs2028373，rs11046349 位点基因型与脐血IgE水平无明显相关性。

表4 位点基因型对血浆总IgE的影响(±s)

表4 位点基因型对血浆总IgE的影响(±s)

GG 1.07±1.24 AA 0.56±1.21 1.446 0.238 rs2028373 AG 0.45±0.91 GG 0.77±1.21 TT 0.57±1.12 0.089 0.915 rs11046349 TG 0.57±0.90 GG 0.25±0.21

讨 论

世界变态反应组织(World Allergy Organization，WAO)在世界首个过敏性疾病日公布了对30个国家进行的过敏性疾病流行病学调查结果，在这些国家的12亿总人口中，约2.5亿人 (占22%)患有IgE介导的过敏性疾病，包括过敏性鼻炎、哮喘、结膜炎、湿疹、食物过敏、药物过敏和严重过敏反应等。全球每年支出约79亿美元用于过敏性疾病的治疗及其间接经济支出。因此，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)已把过敏性疾病列为21世纪需重点研究和防治的三大疾病之一。目前，上海儿童哮喘的发病率已达到6%左右，其中至少80%儿童患者均由过敏因素诱发。过敏性疾病通常病程较长，并且容易反复发作，影响患病儿童的生长发育、生活和学习，给患者和家庭的生活质量、儿童的身心健康与教育发展以及社会的经济和进步都有负面作用。因此，从过敏性疾病发生的机制入手，寻找易感基因、探讨遗传机制，可以为过敏性疾病的预测，个体化的预防与干预措施及其药物的研发提供实验依据和理论支撑。

免疫球蛋白E(IgE)是过敏性疾病的重要介导物质，同时也是判断疾病严重程度及用药效果的指标，其合成是经过B淋巴细胞类别转换重组(class switch recombination，CSR)完成的。而AID的发现是B细胞CSR机制中的重大发现，其诱导和启动了CSR过程。编码AID的AICDA基因突变与Hyper-IgM综合征(Autosomal recessive form of hyper-IgM syndrome，HIGM2)密切相关，该病患者血清IgM水平明显升高，而其它免疫球蛋白亚型则原发性免疫缺陷，这表明AICDA基因的突变导致了各类型免疫球蛋白类别转换的缺失。一些研究已经报道了血清IgE水平，过敏性疾病以及AICDA基因多态性之间的关联［8-9］:2001年，Emiko Noguchi等［10］研究发现日本人群中存在rs2518144、rs2028373、rs11046349 这 3 个位点的突变型;2003年，Isidoro-Garcia等［11］在西班牙人群中也研究了相关SNP位点。

在母婴遗传研究中，过敏的遗传易感性早已众所周知。在妊娠第11周，胎儿就开始产生免疫球蛋白E。研究证实，脐血IgE增高的婴儿其日后发生哮喘等过敏性疾病的几率明显增多，提示遗传因素对个体的IgE基础水平起着决定性的作用［12-13］。Scirica CV 等［14］也指出脐血 IgE 水平的高低，可作为筛查过敏高危患儿的指标。

在过敏性疾病的发生发展中，先天的遗传背景和后天的生活方式、环境因素起了非常重要的作用。IgE不能通过胎盘屏障，可以排除母体IgE水平对脐血IgE水平的影响;胎儿分娩伊始，脐血IgE并未受到后天因素的影响，故本研究选取新生儿脐血作为研究对象。为了解新生儿家族过敏史与脐血IgE的关系，探索AICDA基因多态性位点基因型对脐血IgE水平的影响，本研究检测了新生儿脐血的总IgE水平和AICDA基因rs2518144，rs2028373，rs11046349 3个位点的基因型;发现患有过敏性疾病的产妇其新生儿脐血的AICDA rs2028373位点GG基因型频率明显低于对照组，提示G等位基因可能是新生儿过敏性疾病发生的保护性因素。

目前AICDA基因在过敏性疾病过程中的作用尚未完全明确，其基因多态性与过敏的关系仍在不断研究。而本研究是对AICDA基因与过敏性疾病相关性的初步调查，更大样本的相关研究，功能机制探寻，以及多个相关SNP位点在RNA的转录水平以及细胞因子水平的关系仍在进一步研究之中，对AICDA基因研究的不断深入将为过敏基因的确立，过敏的预测，防治和治疗提供新的线索和途径。本课题是过敏性疾病遗传易感和遗传相关因素研究的一次探索和尝试，研究对象、样本选取、备选基因及其位点、亲属相关参数、样本量以及出生后跟踪分析周期、间歇和频度等都将在后续的课题研究中慎重考虑和完善。以期为过敏性疾病预测、预防和个体化关怀、治疗提供有益的实验依据和帮助。

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