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贵州省首例空肠弯曲菌菌血症病例病原鉴定和亚种分型

2014-11-20韦小瑜田克诚唐光鹏王定明

中国人兽共患病学报 2014年8期
关键词:菌血症亚种空肠

韦小瑜,田克诚,游 旅,唐光鹏,王定明

Email:weixyuse@foxmail.com

弯曲菌是重要的食源性人兽共患病原菌,可引起人类急性肠炎,并可并发格林巴利综合征、菌血症、活动性关节炎等多种疾病[1]。本文从1例新生儿剥脱性皮炎患者的血液中分离出疑似空肠弯曲菌,并进行形态学、系统生化和分子生物学鉴定。

1 材料与方法

1.1 病例 患者为出生11d的女婴,家住贵州省仁怀市九仓镇,家中生产。患儿出生8d时出现口周皮肤潮红,渐发展为全身皮肤潮红,面部、四肢、腹部皮肤部分剥脱等症状体征,遂入住遵义医学院附属医院新生儿科,诊断为“新生儿剥脱性皮炎,颅内感染?鹅口疮”。其住院期间最高体温40.6。C(肛温),伴四肢抽搐,反应差。实验室检查:WBC13.87×109/L,中性淋巴细胞比例56%,淋巴细胞比例31%,单核细胞比例12%;肝功能ALT54U/L,AST68U/L,总胆红素92.1umol/L,直接胆红素20umol/L,肌酸激酶359U/L,乳酸脱氢酶572U/L。该医院采用血培养法从患者血液中分离到病原菌,经细菌鉴定仪鉴定为“弗朗西斯菌”,并将菌株送至本室鉴定。

1.2 主要试剂和仪器 哥仑比亚血琼脂基础购自英国OXOID公司,脱纤维羊血购自北京友康基业公司,细菌基因组提取试剂盒购自大连宝生物公司。微需氧培养箱为CB150(Binder,德国);PCR 仪为德国80W-Tprofessional Gradient 96;凝胶成像仪为Gel Doc2000型(Bio-Rad,美国);全自动微生物鉴定仪为VITEK2.0(法国,梅里埃)。引物合成由大连宝生物公司完成。

1.3 试验菌和参考菌株 试验菌株分离自“新生儿剥脱性皮炎”患者血液的“弗朗西斯菌“疑似菌株,编号:GZ201201,参考菌株由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供(CJ参考株)。

1.4 传统细菌学方法鉴定空肠弯曲菌 按照 WS271-2007标准进行,试验内容包括菌落培养条件、观察菌落生长时间、形态、菌落染色、氧化酶和触酶试验等。

1.5 系统生化鉴定空肠弯曲菌 采用梅里埃VITEK2.0全自动微生物鉴定仪,将试验菌和空肠弯曲菌参考菌株制成菌悬液后,上NH卡进行微生物系统生化鉴定。

1.6 DNA提取 将试验菌和参考菌株接种至哥仑比亚血平板培养48h后,使用细菌基因组提取试剂盒按照说明书操作步骤提取细菌DNA。

1.7 多重PCR方法鉴定空肠弯曲菌 按照文献[2]提供的16sRNA、mapA引物序列和参数对试验菌和参考菌株核酸进行扩增,以参考菌株核酸作为阳性对照,超纯水作为阴性对照。

1.8 NAP-mPCR方法鉴定空肠弯曲菌亚种 采用文献[3]所述NAP-mPCR引物序列和参数对试验菌和参考菌株进行空肠弯曲菌亚种的鉴定,引物序列见表1。

表1 NAP-mPCR用引物Tab.1 Primers used in NAP-mPCR

2 结 果

2.1 试验菌形态、染色及常规生化鉴定结果 试验菌转种至哥仑比亚选择性血平板,37。C普通培养箱培养48h后未见菌落生长,42。C微需氧培养箱(85%N2,10%CO2,5%O2)培养48h后,可见大小约0.5~1mm、圆形、边缘整齐、无色透明、水滴状、表面光滑湿润、不溶血的菌落;挑选典型菌落进行革兰染色镜检,菌体形态为革兰染色阴性、呈S形或海鸥展翅状、无芽孢的细长弯曲菌;试验菌触酶、氧化酶和马脲酸盐水解试验均为阳性。符合空肠弯曲菌的生长条件、菌落形态和基础生化特征。

2.2 系统生化鉴定结果 将试验菌和空肠弯曲菌参考菌株进行全自动微生物系统生化鉴定,结果显示两种菌均为空肠弯曲菌空肠亚种,鉴定度为99%,见表2。

表2 疑似空肠弯曲菌菌株的系统生化鉴定结果Tab.2 Identification on suspicious strain of Campylobacter jejuni by VITEK biochemical methods

2.3 多重PCR方法鉴定结果 采用特异性种属多重PCR方法对试验菌株和参考菌株核酸进行扩增,结果显示两种菌均获得857bp(16sRNA)及589bp(mapA)两条特异性扩增片断,而阴性对照无条带扩增。

2.4 NAP-mPCR 方法鉴定结果采用 NAP-mPCR方法对试验菌和参考菌株核酸进行检测,结果显示两种菌均获得1 454bp和1 016bp的两条特异性条带,而阴性对照无条带出现(图1)。

3 讨 论

空肠弯曲菌是引起世界食源性疾病的常见病原菌,常引起肠道感染,每1 000个肠道感染的病例就有1.5个会发展为菌血症或败血症,而且0.1%的弯曲菌感染病例,尤其空肠弯曲感染会发展为格林巴利综合征[4]。空肠弯曲菌分为两个亚种:空肠亚种和德莱亚种。本试验研究证实从贵州省1例菌血症患儿的血液中分离到空肠弯曲菌,经传统细菌学方法、特异性种属mPCR方法和NAP-mPCR方法鉴定为空肠弯曲菌空肠亚种。

图1 血培养空肠弯曲菌分离株NAP-mPCR结果Fig.1 NAP-mPCR results of the Campylobacter jejuni strain from blood culture

本实验通过观察菌落生长条件和菌落形态、菌落染色、氧化酶、触酶试验及系统生化鉴定将试验菌鉴定为空肠弯曲菌空肠亚种,提示传统的表型分型仍然可作为空肠弯曲菌分型的手段,但传统的表型分型实验过程需要的菌量较大,耗时较长,且会出现错误的判断结果[3]。而PCR方法仅需单个菌落提取核酸进行反应,实验时间短,特异性强,优于传统表型分型方法。本研究中采用基于16sRNA、mapA两个基因的多重PCR技术将菌血症患者血培养分离菌株鉴定为空肠弯曲菌,该方法亦曾在贵州省腹泻病例空肠弯曲菌的鉴定中得到应用[5]。

空肠弯曲菌亚种的表型鉴定主要通过硝酸盐还原试验来判断,但该方法耗时长需1~2d,所需菌量大,而且会出现错误结果,Miller[3]以硝酸盐还原酶(nitrate reductase,nap)位点为基础设计的多重PCR(NAP-mPCR)检测方法,对分离自临床病例、动物和环境的158株空肠弯曲菌空肠亚种和20株空肠弯曲菌德莱亚种研究结果显示,该方法可对空肠弯曲菌空肠亚种(1 454bp,1 016bp)和德莱亚种(973bp或494bp)进行100%的分型鉴定。本实验中GZ201201和CJ参考株经NAP-mPCR方法检测鉴定为空肠弯曲菌空肠亚种,与系统生化检测结果完全一致。

最初,本菌株被医院实验室鉴定为“弗朗西斯菌”,与最终鉴定结果不符。因空肠弯曲菌培养条件苛刻,其在不同的培养条件下生长速度、形态大小及菌落革兰染色形态均有不同,在不利于其生长的条件下生长速度缓慢,菌落小,革兰染色出现菌体球形变化,仅少许呈弯曲状,因此导致进行系统生化鉴定时可能会出现选卡错误而识别为其他菌。

弯曲菌是引起儿童肠炎的常见病原菌,其菌血症的发生常发生于免疫缺陷的儿童[6]。本例空肠弯曲菌空肠亚种菌血症患者为新生儿,免疫力低下,大片皮肤剥脱,皮肤屏障破坏,全身皮肤感染重,致使病原菌侵入血液引起菌血症。贵州省1988年和2010年均在腹泻病例的病原监测中检出空肠弯曲菌[7-8]。

[1]Blaser M,Engberg J.Clonal distribution and virulence of Campylobacter jejuni isolates in blood[J].Emerg Infect Dis,2013,19(10):1653-1655.DOI:10.3201/eid1910.121537

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[3]Miller WG,Parker CT,Heath S,et al.Identification of genomic differences betweenCampylobacterjejunisubsp.jejuniandC.jejunisubsp.doyleiat thenaplocus leads to the development of aC.jejunisubspeciation multiplex PCR method[J].BMC Microbiol,2007,7(2):7-11.DOI:10.1186/1471-2180-7-11

[4]Martiny D,Dediste A,Debruyne L.Accuracy of the API Campy system,the Vitek 2Neisseria--Haemophilus card and matrixassisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry for the identification of Campylobacter and related organisms[J].Clin Microbiol Infect,2011,17(7):1001-1006.DOI:10.1111/j.1469-0691.2010.03328.x

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