陈鹏　郭成金

摘要：采用正交试验方法对影响金针菇[Flammulina velutipes（Curt.：Fr.）Sing.]原生质体制备、再生的主要因素进行探究，结果表明，金针菇原生质体最佳再生体系为：培养7 d的菌丝体，在1%溶壁酶、1%蜗牛酶组成的混合酶中，以0.6 mol/L MgSO4·7H2O作为渗稳剂，在30 ℃下酶解4 h，经过3次验证试验，金针菇原生质体再生率高达0.851 7。最佳制备体系为：培养9 d的菌丝体，在2%溶壁酶中，以0.6 mol/L蔗糖作为渗稳剂，在26 ℃下酶解4 h，此条件下金针菇原生质体的制备率高达2025×107个/mL。

关键词：金针菇；正交试验；原生质体；再生；融合；诱变

中图分类号： S646.1+50.36文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0200-05

收稿日期：2013-12-03

基金项目：国家星火计划 （编号：2012GA610002）

作者简介：陈 鹏（1989—），女，天津人，硕士研究生，主要从事蕈菌生物学研究。Tel：（022）23765561；E-mail：630261583@qq.com。

通信作者：郭成金，教授，主要从事植物细胞营养及蕈菌生物学研究。Tel：（022）23765561；E-mail：chengjin@vip.sina.com。金针菇[Flammulina velutipes（Curt.：Fr.）Sing.]别称冬菇、朴菇、构菌、青杠菌、毛柄金钱菌等，隶属担子菌亚门（Basidiomycotina）层菌纲（Hymenomycetes）伞菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）金钱菌属（Flammulina）[1]。金针菇菌盖滑嫩、菌柄细长脆质、形美、味鲜，富含多种维生素、矿物质，不含胆固醇，富含赖氨酸、精氨酸，能促进幼儿大脑发育[2]。金针菇药用价值很高，金针菇具有抗肿瘤、护肝作用，是世界上著名的观赏菌、食药兼用菌，是目前工厂化生产技术最成熟的菇类之一[3-4]。原生质体指将细胞壁破除后由质膜包裹的裸露的细胞结构[5]。1973年，有学者将原生质体融合技术运用到蕈菌研究领域。目前原生质体融合技术已成为研究蕈菌生理、生化、遗传等基础理论、改良菌种的重要方法。有学者采用单因素试验对金针菇原生质体制备、再生进行了研究，但再生率均不高[6-7]。笔者在前人的基础上首次采用正交试验方法对影响金针菇原生质体制备、再生条件进行优化，旨在为开展金针菇原生质体融合、诱变研究提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌种金针菇保藏种由天津师范大学蕈菌研究所提供。

1.1.2试剂葡萄糖、蔗糖、甘露醇、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、维生素B1、KCl、NaCl、琼脂（天津福晨化学试剂厂）、溶壁酶（广东省微生物研究所）、蜗牛酶、纤维素酶（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）、马铃薯、棉籽皮、玉米粉。

1.1.3仪器与设备YXQG02手提式压力蒸汽消毒器（山东新华医疗器械厂）、SW-CJ-2FD双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）、WDP型微生物多用培养箱（广东省医疗器械厂）、TGL-16G高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）、BS224S电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）、HH-S恒温水浴锅（江苏省医疗仪器厂）、血球计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司）、Galen光学显微镜（Gambrige公司）、针头式滤器、0.22 μm微孔滤膜（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。

1.1.4培养基PDA综合培养基：马铃薯 20.00%（浸提液）、棉籽皮20.00%（浸提液）、葡萄糖 2.00%、KH2PO4 030%、MgSO4·7H2O 0.15%、维生素B1 0.0004%、琼脂 200%，pH值自然[8]。液体培养基：玉米粉 3.00%（浸提液）、马铃薯15.00%（浸提液）、葡萄糖 0.50%、KH2PO4 002%、KH2PO4 0.08%、MgSO4·7H2O 0.05%、pH值 6.0～65。再生培养基：液体培养基+0.8%琼脂，以0.6 mol/L甘露醇配得，pH值自然。再生对照培养基：液体培养基+08%琼脂，以蒸馏水配得，pH值自然。渗稳剂：甘露醇、蔗糖、KCl、NaCl 均为0.6 mol/L。

1.2方法

1.2.1菌丝体的培养取斜面培养基上经提纯复壮后生长旺盛的菌丝体尖端接种于液体培养基表面，25 ℃静置培养 5～11 d，每隔24 h手摇1次。

1.2.2酶液的配制按表1称取各种酶置于4 mL离心管中，用相应渗稳剂溶解，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后备用。

1.2.3原生质体的分离在无菌操作下取培养好的菌丝体湿质量约500 mg置于4 mL离心管中，6 000 r/min离心 10 min，弃上清液，用相应的渗稳剂洗涤3次，用无菌滤纸吸去多余水分。4 mL离心管中，每100 mg湿菌丝体加1 mL酶液，每管放入2粒直径为2.5 mm的无菌玻璃珠，在恒温水浴锅中进行酶解。吸取1～10 μL酶解液，用血球计数板计算原生质体的初步得率。

1.2.4原生质体的纯化酶解一定时间后，用孔径为18 μm的无菌滤网过滤原生质体悬液，除去残余的菌丝体片段。滤液4 000 r/min离心10 min，弃上清液，用渗透压稳定剂洗涤3次，得到纯化的原生质体。吸取少许悬液，置于显微镜下观察，用血球计数板计算原生质体最终得率。

1.2.5原生质体再生将纯化的原生质体悬液稀释至浓度为105个/mL，吸取0.2 mL涂布在再生培养基上，另取0.2 mL用无菌水稀释的原生质体悬液涂布在对照培养基上，作为对照。培养8～15 d后记录再生菌落数，每处理重复3次，再生率计算公式如下：endprint

原生质体再生率=（再生菌落数-对照组再生菌落数）/涂布的原生质体总数×100%。

2结果与分析

2.1原生质体的释放方式

金针菇原生质体有4种释放方式。酶解反应初期无原生质体释放，但菌丝出现断裂，菌丝变粗、变短且膨大，在菌丝顶端部位细胞的细胞壁被溶解，原生质体从细胞壁缺口溢出，原生质体呈球形，通常金针菇菌丝以这种方式从缺口释放1～2个原生质体。0.5 h后，菌丝慢慢变得疏松，菌丝侧面出现孔洞，原生质体从侧面被释放出来。随着酶解时间的延长，一些菌丝细胞壁横隔被溶解，大部分菌丝裂解成菌丝段，原生质体从菌丝段的一端或两端释放出来。当酶解比较彻底时，质壁分离，在内外环境的压力下，原生质体从孔洞溢出，呈串珠排列在原位（图1）。

2.2影响原生质体制备的因素

由表2可知，各因素对原生质体制备率的影响由大到小依次为：酶组成及浓度>酶解时间>渗稳剂>菌龄>酶解温度。最佳原生质体制备条件组合为A2B4C1D4E3。即培养9 d的菌丝体，在2%溶壁酶中，以0.6 mol/L蔗糖作为渗稳剂，在26 ℃下酶解4 h，此条件下金针菇原生质体的制备率高达2025×107个/mL，原生质体大小均匀、质膜完整、平滑明亮（图2）。

2.3影响原生质体再生的因素

胞分裂和萌发3个相互联系又具有一定独立性的生理过程，是细胞自我修复的过程。它有利于克服菌种退化，保持菌种自身的优良性状。原生质体制备条件直接影响原生质体的再生能力，因此采用正交试验对影响原生质体制备的5个因素进行研究。由表3可知，各因素对原生质体再生影响程度由大到小依次是酶解时间>酶组成及浓度>渗稳剂>酶解温度>菌龄。最佳原生质体制备条件组合为A3B1C3D4E2。即培养7 d的菌丝体，在1%溶壁酶、1%蜗牛酶组成的混合酶中，以0.6 mol/L MgSO4·7H2O作为渗稳剂，在30 ℃下酶解4 h。经过3次验证试验，金针菇原生质体再生率高达8517%，与前人研究得到的金针菇再生率相比提高了60%[6]。

2.4渗稳剂种类与原生质体再生的关系

参照表3的金针菇原生质体最佳再生条件：培养7 d的菌丝体，在1%溶壁酶、1%蜗牛酶组成的混合酶中，以 0.6 mol/L MgSO4·7H2O作为渗稳剂，在30 ℃下酶解4 h，比较不同渗稳剂对金针菇原生质体再生率的影响。

由表4可知，以甘露醇、蔗糖作为渗稳剂，金针菇再生率高于无机盐类，尤其以甘露醇作为渗稳剂时金针菇再生率最高，再生菌落长出的时间也最短；以NaCl作为渗稳剂时，金针菇再生率最低，且再生菌落长出的时间也最长。4种不同的再生培养基中，原生质体的再生率相差较大，这可能是由于渗稳剂的种类不同导致原生质体对其利用、转化的速度也不同。不同渗稳剂培养基上的菌落长势如图3所示。

2.5原生质体再生情况

在最佳渗稳剂的再生培养基上暗培养4 d可以看到一个半透明的白色印记，边缘不规则，呈辐射状。5～7 d时，菌落的痕迹变得清晰，呈白色不规则的圆形，以再生点为中心辐射状生长。8 d以后，菌落向四周扩大，金针菇的气生菌丝比较旺盛，随着时间的推移，辐射状愈加明显，边缘不规则，且开始分泌色素，中心泛黄，边缘菌丝白色，最终再生菌落布满整个再生培养基（图4）。

3结论与讨论

3.1原生质体制备的相关因素

3.1.1酶液组成对原生质体制备率的影响蕈菌的细胞壁较复杂，使用酶法破壁制备原生质体时，酶很关键。复合酶的酶解效果较单一酶效果好。溶壁酶是一种活力很强的复合酶[9]。本研究表明，单独使用溶壁酶比使用其他混合酶的效果要好，这与前人研究结果[10-12]一致。由于高浓度的酶液对原生质体有一定的损伤作用，酶解过于彻底会影响原生质体再生，为提高原生质体的活力，采用较低浓度的酶液配比，结果表明，2%溶壁酶效果最好。

3.1.2渗稳剂对原生质体制备率的影响原生质体制备中，渗透压稳定剂不仅能保护原生质体免于因渗透压差值过大而破裂，而且有助于酶与底物结合[13]。细胞破壁后，原生质体表3原生质体再生正交试验结果与极差分析

3.1.3酶解温度对原生质体制备率的影响随着温度的增加，酶易失活，原生质体也易破损，产量不再增加。25～37 ℃温度范围内，酶解反应都能进行，但对于不同的酶体系来说，最适的酶解温度不同[15]。本研究表明，26 ℃时金针菇原生质体产量最高，这与前人研究结果[6]一致。

3.1.4酶解时间对原生质体制备率的影响本研究表明，随着酶解时间的延长，菌丝逐渐变得疏松，开始断裂，原生质体制备率逐渐增加，随着酶解时间的延长，原生质体制备率有增加的趋势，酶解4 h，制备率最高达2.025×107个/mL。

3.1.5菌龄对原生质体制备率的影响菌龄是影响原生质体释放的重要因素，菌丝体的不同生理状态直接影响细胞壁的结构、菌丝体代谢水平。菌龄过短，酶解时原生质体易破裂，稳定性差[16]。以菌龄为9 d的金针菇菌丝体制备原生质体时原生质体产量最高，但随着培养时间的延长，原生质体产量下降，可能是由于老龄化菌丝细胞壁较厚，菌丝细胞壁上容易沉积色素等次生物质，酶的作用减弱，原生质体产量减少，故最佳菌龄为9 d。

3.2再生相关因素的原生质体

3.2.1酶液组成对原生质体再生率的影响本研究表明，用混合酶制备出的原生质体再生率高于用单一酶制备出的原生质体再生率。用1%溶壁酶、1%蜗牛酶组成的混合酶制备出的原生质体再生率最高，达0.851 7，这与之前的最佳制备酶条件不同，因为适合原生质体制备的条件不一定适合其再生。有文献报道，破壁后的适量细胞壁组分可促进细胞壁的再生[17]。本研究表明，经酶解后一定量的细胞残壁可以作为合成细胞壁的“引物”，有助于细胞壁再生。endprint

3.2.2渗稳剂对原生质体再生率的影响渗透压稳定剂的主要作用是维持原生质体内外渗透压的平衡[18]。无机盐类不利于再生可能是因为盐对细胞壁降解有促进作用。笔者认为，原生质体再生体系的作用是促进细胞壁的形成以及胞内各细胞器、超分子复合物功能修复及均衡养分。原生质体制备体系及再生体系的共性在于细胞渗透压的稳定。

3.2.3酶解温度对原生质体再生率的影响酶解温度也影响原生质体再生。本研究表明，金针菇原生质体再生率随着温度的升高有上升的趋势，当温度超过30 ℃时，再生率开始下降，高温会损伤原生质体活性，进而影响其再生，所以金针菇原生质体再生的最适温度为30 ℃。

3.2.4酶解时间对原生质体再生率的影响本研究表明，酶解1～2 h，原生质体释放不彻底，再生率较低；酶解4 h时，原生质体释放较完全，原生质体结构功能也较完整，再生率最高。

3.2.5菌龄对原生质体再生率的影响本研究表明，菌龄为7 d时，金针菇原生质体再生率最高，小于或超过7 d菌龄，菌丝细胞或过于幼嫩或已老化均不易被酶解，原生质体活力弱，再生率呈下降趋势。菌龄过短的菌丝细胞经酶解破壁形成的原生质体，有的细胞器不完全，功能尚未完善，再生能力较低。由于处在生长对数期的细胞内含物多、功能完善，所以原生质体再生率高、再生时间短。菌龄过长同样不适合再生，由于细胞壁较老，酶解困难，整个原生质体可能从酶解所生成的小孔中流出。

4结论

本研究通过正交试验对金针菇原生质体制备、再生条件进行优化，得到金针菇原生质体最佳再生体系为：培养7 d的菌丝体，在1%溶壁酶、1%蜗牛酶组成的混合酶中，以 0.6 mol/L MgSO4·7H2O作为渗稳剂，在30 ℃下酶解4 h，经过3次验证试验，金针菇原生质体再生率高达0.851 7。最佳制备体系为：培养9 d的菌丝体，在2%溶壁酶中，以 0.6 mol/L 蔗糖作为渗稳剂，在26 ℃下酶解4 h，此条件下金针菇原生质体的制备率高达2.025×107个/mL，原生质体大小均匀、质膜完整、平滑明亮。

参考文献：

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3.2.2渗稳剂对原生质体再生率的影响渗透压稳定剂的主要作用是维持原生质体内外渗透压的平衡[18]。无机盐类不利于再生可能是因为盐对细胞壁降解有促进作用。笔者认为，原生质体再生体系的作用是促进细胞壁的形成以及胞内各细胞器、超分子复合物功能修复及均衡养分。原生质体制备体系及再生体系的共性在于细胞渗透压的稳定。

3.2.3酶解温度对原生质体再生率的影响酶解温度也影响原生质体再生。本研究表明，金针菇原生质体再生率随着温度的升高有上升的趋势，当温度超过30 ℃时，再生率开始下降，高温会损伤原生质体活性，进而影响其再生，所以金针菇原生质体再生的最适温度为30 ℃。

3.2.4酶解时间对原生质体再生率的影响本研究表明，酶解1～2 h，原生质体释放不彻底，再生率较低；酶解4 h时，原生质体释放较完全，原生质体结构功能也较完整，再生率最高。

3.2.5菌龄对原生质体再生率的影响本研究表明，菌龄为7 d时，金针菇原生质体再生率最高，小于或超过7 d菌龄，菌丝细胞或过于幼嫩或已老化均不易被酶解，原生质体活力弱，再生率呈下降趋势。菌龄过短的菌丝细胞经酶解破壁形成的原生质体，有的细胞器不完全，功能尚未完善，再生能力较低。由于处在生长对数期的细胞内含物多、功能完善，所以原生质体再生率高、再生时间短。菌龄过长同样不适合再生，由于细胞壁较老，酶解困难，整个原生质体可能从酶解所生成的小孔中流出。

4结论

本研究通过正交试验对金针菇原生质体制备、再生条件进行优化，得到金针菇原生质体最佳再生体系为：培养7 d的菌丝体，在1%溶壁酶、1%蜗牛酶组成的混合酶中，以 0.6 mol/L MgSO4·7H2O作为渗稳剂，在30 ℃下酶解4 h，经过3次验证试验，金针菇原生质体再生率高达0.851 7。最佳制备体系为：培养9 d的菌丝体，在2%溶壁酶中，以 0.6 mol/L 蔗糖作为渗稳剂，在26 ℃下酶解4 h，此条件下金针菇原生质体的制备率高达2.025×107个/mL，原生质体大小均匀、质膜完整、平滑明亮。

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[14]郭成金，杨子美. 槐耳原生质体制备与再生研究[J]. 天津师范大学学报：自然科学版，2010，30（4）：63-67.

[15]张志光. 真菌原生质体技术[M]. 长沙：湖南科学技术出版社，2003：79-86.

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3.2.2渗稳剂对原生质体再生率的影响渗透压稳定剂的主要作用是维持原生质体内外渗透压的平衡[18]。无机盐类不利于再生可能是因为盐对细胞壁降解有促进作用。笔者认为，原生质体再生体系的作用是促进细胞壁的形成以及胞内各细胞器、超分子复合物功能修复及均衡养分。原生质体制备体系及再生体系的共性在于细胞渗透压的稳定。

3.2.3酶解温度对原生质体再生率的影响酶解温度也影响原生质体再生。本研究表明，金针菇原生质体再生率随着温度的升高有上升的趋势，当温度超过30 ℃时，再生率开始下降，高温会损伤原生质体活性，进而影响其再生，所以金针菇原生质体再生的最适温度为30 ℃。

3.2.4酶解时间对原生质体再生率的影响本研究表明，酶解1～2 h，原生质体释放不彻底，再生率较低；酶解4 h时，原生质体释放较完全，原生质体结构功能也较完整，再生率最高。

3.2.5菌龄对原生质体再生率的影响本研究表明，菌龄为7 d时，金针菇原生质体再生率最高，小于或超过7 d菌龄，菌丝细胞或过于幼嫩或已老化均不易被酶解，原生质体活力弱，再生率呈下降趋势。菌龄过短的菌丝细胞经酶解破壁形成的原生质体，有的细胞器不完全，功能尚未完善，再生能力较低。由于处在生长对数期的细胞内含物多、功能完善，所以原生质体再生率高、再生时间短。菌龄过长同样不适合再生，由于细胞壁较老，酶解困难，整个原生质体可能从酶解所生成的小孔中流出。

4结论

本研究通过正交试验对金针菇原生质体制备、再生条件进行优化，得到金针菇原生质体最佳再生体系为：培养7 d的菌丝体，在1%溶壁酶、1%蜗牛酶组成的混合酶中，以 0.6 mol/L MgSO4·7H2O作为渗稳剂，在30 ℃下酶解4 h，经过3次验证试验，金针菇原生质体再生率高达0.851 7。最佳制备体系为：培养9 d的菌丝体，在2%溶壁酶中，以 0.6 mol/L 蔗糖作为渗稳剂，在26 ℃下酶解4 h，此条件下金针菇原生质体的制备率高达2.025×107个/mL，原生质体大小均匀、质膜完整、平滑明亮。

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