刘贤勇 索 勋

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)

艾美耳球虫是顶复门(Phylum Apicomplexa)原虫中的一大类，其属于艾美耳科(Eimeriidae)、艾美耳属Eimeria。艾美耳球虫广泛寄生于两栖动物至哺乳动物。目前已经报道的艾美耳球虫超过1 800种, 而据推测，这一数字仅占寄生于所有哺乳动物的艾美耳球虫种的1.4% (Duszynskietal., 2011)。艾美耳球虫感染而致的球虫病给畜牧业生产带来了极为严重的经济损失，全球每年因球虫病(包括防治费用)给养禽业造成的损失即超过30亿美元(Blakeetal., 2014)。

长期以来，球虫病的防治以药物为主。然而随着球虫抗药性的产生及药物残留对公众健康的危害逐渐被认识，许多抗球虫药已经或正在退出市场。由于多种原因，上世纪90年代以来几乎没有抗球虫新药上市(Abbasetal., 2011)。球虫病活卵囊疫苗投入应用半个多世纪以来，在鸡球虫病预防中发挥了重要的作用(Williams, 2002)。遗憾的是，市场上还没有针对其他畜禽的球虫病疫苗。因此，畜禽球虫病防治目前面临着缺乏安全有效的药物和疫苗的困境。开发新型抗球虫药物及疫苗需要寻找艾美耳球虫细胞内的特异性药物靶点或是抗原分子。大量研究表明，顶复门原虫的顶质体(Apicoplast)为其特有，是抗原虫药物开发的重要靶点(Fleigeetal., 2010)。由此看来，艾美耳球虫在细胞发育、代谢途径等与宿主存在的显著差异将为抗球虫药物开发提供新思路。另一方面，在畜禽抗球虫免疫应答机制逐步被揭示的同时，艾美耳球虫的免疫原性研究也取得一定进展，为新型抗球虫疫苗的研制提供了理论依据(Sharmanetal., 2010)。

转基因技术因其可实现特定靶基因的过表达、敲除、插入及突变，逐渐成为生命科学领域最重要的理论和技术研究手段之一。在顶复门原虫中，刚地弓形虫Toxoplasmagondii、恶性疟原虫Plasmodiumfalciparum转基因研究获得成功(Goonewardeneetal., 1993; Soldatietal., 1993)，为其他近缘物种、包括艾美耳属球虫的转基因操作奠定了良好基础。本文将就艾美耳球虫转基因研究工作进行回顾和展望。

1 艾美耳球虫转基因研究进展

1998年，英国的Tomley研究小组利用微线体1基因的调控序列作为启动子成功实现了β-半乳糖苷酶表达载体在柔嫩艾美耳球虫E.tenella子孢子中的瞬时转染(Kelleheretal., 1998)，开启了艾美耳球虫转基因研究的序幕。我们研究团队利用黄色荧光蛋白及红色荧光蛋白作为报告基因，实现了艾美耳球虫瞬时转染的活细胞实时检测(Haoetal., 2007)，为艾美耳球虫转染研究提供了更为简便的操作程序。随后我们及Tomley的研究团队先后在提高瞬时转染效率、实现稳定转染、利用抗药基因进行药物筛选等方面获得成功(Clarketal., 2008; Liuetal., 2008; Yanetal., 2009)。最近我们还利用单孢子囊分离技术建立了转基因球虫系EtM2e (Liuetal., 2013)上述研究工作是利用艾美耳球虫的代表性虫种柔嫩艾美耳球虫完成的，其盲肠寄生的特征使得经泄殖腔接种的被转染子孢子可通过回盲口进入盲肠而完成其内生性发育，简化了稳定转染及体内筛选过程。同样的接种策略也使得和缓艾美耳球虫E.mitis的稳定转染获得成功(秦梅等, 待发表数据)。通过将转染后的子孢子经口接种至胃酸被中和的大鼠，尼氏艾美耳球虫E.nieschulzi的转染也而获得了成功(Kurthetal., 2009),且转基因的尼氏艾美耳球虫在大鼠胚胎原代细胞中发育至配子体和卵囊(Hanigetal., 2012; Chenetal., 2013)。斯氏艾美耳球虫E.stiedai、肠艾美耳球虫E.intestinalis的稳定转染则是通过外科手术将转染后的子孢子直接接种于十二指肠而获得成功(刘贤勇等, 待发表数据)。

表1 已进行过转染研究的艾美耳球虫种类Tab. 1 Eimeria spp. have been used for transfection

2 艾美耳球虫的转基因研究技术

根据目前构建转基因球虫获得成功的研究结果及我们研究小组的实验室操作经验，艾美耳球虫转基因研究的流程大致为：构建含有艾美耳球虫基因调控序列的报告基因载体，转染纯化后的子孢子，接种于细胞培养观察瞬时转染成功与否；或者接种至体内(如回盲口)并连续传代筛选出稳定转染群体，进而鉴定基因插入位点和表型，最终通过单孢子囊分离技术获得遗传性能一致的转基因球虫系(图1)。

图1 转基因艾美耳球虫的构建流程Fig. 1 The flowchart for the construction of transgenic eimerian parasites载体构建可用yfp基因作为报告基因，同时可以加入源自刚地弓形虫的药物筛选基因dhfr-ts，而在双表达框载体中，另外一个表达框可表达感兴趣的外源基因，如禽流感病毒的ha1基因。体外转染可以采用电穿孔仪或核转染仪。筛选与传代培养则是利用流式细胞分选技术和/或药物筛选压力，连续传代后代卵囊至获得稳定转染群体，最后利用单孢子囊分离技术获得转基因艾美耳球虫系。转基因球虫鉴定通常采用免疫荧光或免疫印迹来鉴定外源蛋白的表达，同时用染色体步移或质粒拯救和DNA测序来确定转基因在球虫染色体上的整合位点。For the construction of expression vectors, yfp is used as reporter gene in the expression cassette, within which the in-frame fused dhfr-ts2m3m gene is used for drug selection; while interested foreign gene, such as ha1 derived from avian influenza virus, can be inserted into another expression cassette. For the in vitro transfection, Electroporation apparatus (for example, Gene Pulser XcellTM from Bio-Rad or NucleofectorTM from Lonza) can be used for the delivering of plasmid DNA into sporozoites. Selecting and passaging transfectants is carried out by virtue of flow cytometer sorting and/or pyrimethamine selecting. Via single-sporocyst isolation, transgenic lines of eimerian parasites can be obtained from stable transfected population after the successive passaging of the progeny oocysts. The verification of transgenic parasites can be performed with indirect immunofluorescent assay (IFA) or Western blot for the identification of foreign protein expression and genome walking and plasmid rescue for the determination of integration sites of the foreign gene.

现有的研究结果表明，当报告基因5′及3′的调控序列都源自艾美耳球虫基因(如组蛋白his4、微线体蛋白mic1、肌动蛋白actin)时，黄色荧光蛋白在转染的艾美耳球虫中瞬时或稳定表达。我们发现刚地弓形虫的调控序列，如表面抗原蛋白Sag1和微管蛋白tubulin的启动子序列都可以驱动报告基因在柔嫩艾美耳球虫中的表达(Zouetal., 2009)；而Kurth等(2009)则用柔嫩艾美耳球虫的mic1启动子实现了尼氏艾美耳球虫的瞬时转染，这证实了近缘物种调控序列的保守性。而这种保守性也体现在分泌型蛋白的信号肽序列，如刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA8及恶性疟原虫RIFIN蛋白的信号肽序列也能将荧光蛋白靶向至艾美耳球虫形成的带虫空泡(Shietal., 2009)。

为了进一步实现外源抗原基因的表达，双表达框策略被引入艾美耳球虫转基因研究中。比如在同一个质粒载体中，将黄色荧光蛋白基因置于mic1启动子和actin的3′调控序列之间构建成一个表达框，而将红色荧光蛋白基因置于Actin的5′和3′调控序列之间构建成另一个表达框(Yinetal., 2011)。将禽流感病毒的抗原基因替换双框载体中的红色荧光蛋白后，我们获得了表达ha及np抗原的转基因球虫(殷光文等，待发表数据)。而最近我们将源自口蹄疫病毒的自剪切序列P2A引入表达载体的构建中，实现了同一个表达框中两个报告基因的非融合表达(汤新明等，待发表数据)，为表达多基因的转基因球虫构建奠定了良好基础。

艾美耳球虫转染效率除了受调控元件的选择、载体DNA大小的影响，还受到转染方法、载体DNA是否线性化等因素的影响。电穿孔或核转染是目前实现艾美耳球虫转染的常用手段，而在哺乳动物细胞中普遍应用的化学转化或脂质体转化方法在球虫转基因操作中尚未见成功的报道。利用限制性内切酶将载体DNA线性化可显著提高艾美耳球虫的瞬时转染效率，是艾美耳球虫稳定转染获得成功的重要策略(Liuetal., 2008)。

表达荧光蛋白的艾美耳球虫卵囊中可以利用流式细胞术进行分选，然后对阳性虫体进行再次传代。经过5～10代连续流式分选和传代，逐步提高了发光卵囊在后代群体中的比例。如果构建的球虫转染载体中含有二氢叶酸还原酶-胸苷合成酶突变型基因(dhfr-ts2m3m)，则可以在饲料或饮水中加入乙胺嘧啶药物，饲喂接种转染后子孢子的鸡只(感染后至少18 h后再加入筛选药物)或后续传代的鸡只，则通过3代筛选即可获得群体发光效率为90%的稳定转染群体(Clarketal., 2008)。

尽管基于荧光表达的筛选联合药物筛选可以促成稳定转染群体的获得，但这种转基因群体的遗传性仍然是不一致的，表现为转基因的整合位点是随机的。通过质粒拯救(Plasmid rescue)和染色体步移(Genome walking)等技术可以检测群体中多个整合位点的存在(Yanetal., 2009; Suetal., 2012)。我们最近发现，piggyBac转座子系统可以用于艾美耳球虫的转基因研究，被整合至基因组的DNA分子的特异性位点为TTAA，符合其转座特征(Suetal., 2012)。艾美耳球虫的孢子生殖分别历经1次减数分裂和1次有丝分裂，这导致艾美耳球虫单个卵囊可能是杂合的。因此，为得到遗传一致的转基因艾美耳球虫系，就需要利用单孢子囊分离甚至是单子孢子分离技术来实现此目的。我们用单孢子囊分离技术成功获得了融合表达黄色荧光蛋白的转基因柔嫩艾美耳球虫系EtM2e (Liuetal., 2013)。

3 转基因艾美耳球虫的应用

利用体外细胞培养系统，我们观察了瞬时表达荧光蛋白的柔嫩艾美耳球虫的裂殖生殖及配子生殖阶段的虫体，并借此观察到了虫体带虫空泡向宿主细胞浆延伸的亚细胞结构(Shietal., 2008)。我们将刚地弓形虫的致密颗粒蛋白GRA7与黄色荧光蛋白基因融合后构建表达载体并转染柔嫩艾美耳球虫，发现表达的荧光蛋白定位于艾美耳球虫的带虫空泡或者是子孢子囊腔，证实了在真球虫目(Eucoccidiorida)原虫间致密颗粒蛋白功能的保守性(Yinetal., 2013)。有研究者在转基因尼氏艾美耳球虫卵囊中观察到了1～3个孢子囊而非全部4个孢子囊表达荧光蛋白的现象，证实了孢子生殖阶段存在较高的基因重组频率(Kurthetal., 2009)。研究还表明，转基因尼氏艾美耳球虫可在体外培养的大鼠原代细胞形成的隐窝样组织中完成4代裂殖生殖及配子生殖，并最终形成卵囊(Chenetal., 2013)。我们对转基因球虫EtM2e的生物学特征，如潜在期、免疫原性和致病性进行了观察(Liuetal., 2013; 李秋明等, 2013)，发现EtM2e虫株的潜在期与原始母株相似，但其卵囊产量更高(接种剂量为1 000)，且其保持了很好的免疫原性。我们也利用EtM2e持续表达黄色荧光蛋白的特征研究了艾美耳球虫子孢子的提前逸出现象(Yanetal., 2014)。

研究转基因艾美耳球虫的更大兴趣在于将其开发为活疫苗载体(郝力力等, 2006)。我们的研究证实，转基因艾美耳球虫表达的黄色荧光蛋白具有很好的免疫原性；而与黄色荧光蛋白表达定位于胞浆的转基因球虫相比，黄色荧光蛋白表达并分泌至带虫空泡的转基因球虫能激发更好的黏膜IgA应答(Huangetal., 2011)。英国的研究小组也成功构建了表达空肠弯曲杆菌CjaA抗原的转基因柔嫩艾美耳球虫，用其作为疫苗免疫鸡只后，产生了显著针对病原菌攻毒感染的免疫保护力(Clarketal., 2012)。我们近期利用表达禽流感病毒HA及NP抗原的转基因球虫进行了免疫和病毒攻毒感染试验，结果显示表达ha1的转基因柔嫩艾美耳球虫免疫鸡后可以激发宿主的体液免疫应答和细胞免疫应答，而且可以为同居感染的免疫鸡提供一定程度的保护；而表达NP抗原的转基因柔嫩艾美耳球虫免疫鸡后可以激发宿主的细胞免疫应答，但不能清除流感病毒的感染(殷光文等，待发表数据)。我们申请的基于转基因球虫的“球虫新用途”专利已获得美国专利授权(Suoetal., 2012)，为这种新型载体疫苗的开发和推广提供了良好的知识产权保护。

4 结语与展望

尽管当前艾美耳球虫的转基因研究已经取得了较好的研究成果，但在转基因操作技术和转基因球虫的应用方面仍面临诸多挑战(Chapmanetal., 2013)。直接转染卵囊就是目前最值得期待的技术突破。卵囊转染可以省去子孢子提取及外科手术途径接种等步骤，简便易行。尽管我们及其他研究团队做了大量努力，我们的研究目前还只证实了外源DNA可以被导入巨型艾美耳球虫E.maxima，未观察到转基因的表达(Lietal., 2012)。最近关于曼氏血吸虫S.mansoni虫卵及微小隐孢子虫卵囊转基因成功的报道为我们进行艾美耳球虫卵囊转染提供新的思路(Rinaldietal., 2012; Lietal., 2014)。

如何提高转染效率和提高转基因的表达效率也是当前艾美耳球虫转基因的挑战。利用转座子元件，如piggyBac转座子(Suetal., 2012)，有可能进一步提高艾美耳球虫的转染效率，从而提高转基因成功的可能性。位点特异性重组策略，如基于类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术极有希望成为推动艾美耳球虫转基因研究的新手段 (Cermaketal., 2011; Barrango, 2014)。在提高转基因表达效率方面，需要验证艾美耳球虫自身表达量高的基因、如表面抗原蛋白SAG13的调控序列是否能提高其调控的转基因的转录及翻译水平(汤新明等，未发表数据)。

艾美耳球虫转基因研究取得的重要成就为其防治药物及疫苗的研发描绘了光明的前景，假以时日，基于转基因球虫的活载体疫苗将不仅能实现球虫病的有效防控，还有望成为预防畜禽其他重大疫病的多价疫苗。