赵 帆 杨 泽

表达数量性状位点(eQTLs)是调节mRNA或蛋白质表达水平的基因位点。与多数典型的复杂性状不同的一个重要方面是，eQTLs检测的mRNA或蛋白质几乎都是定位于某一特异性染色体的单个基因产物。eQTLs定位到其单个基因的原位附近被称为顺式(cis)-e QTLs。相反，eQTLs定位到受其调解基因的远处，即通常其位点定位在与其调解基因不同的染色体上，被称为反式(trans)-eQTLs。在1988～1994年，De Vienne［1］和 Damerval［2］进行了全基因组基因表达的定位研究，他们创新的应用了2D蛋白质分离方法，并引入了“蛋白质数量位点(protein quantity locus，PQL)”的概念。在2000年初，诞生了测量mRNA水平的高通量阵列技术，该技术推动着科学家们开始植物、动物和人类eQTLs的大量研究。研究发现:虽然，cis-eQTLs存在于许多类型组织中，但大部分 transeQTLs是组织依赖型。所以，eQTLs对单个基因的作用，即可能是cis，也可能是trans的作用［3］。已知，调控元件的多态性直接修饰着基因的转录水平，而转录水平对于数量性状定位有相当大的应用价值［4］。因此，组合全基因组遗传关联研究和全基因表达检测的数据，将有助于识别机体的eQTLs。

在大样本人群全基因组基础上，同时检测基因表达和遗传变异，通过遗传统计学分析可定位引起转录组数量表达水平差异的数以万计的个体遗传基因变异［5］。研究表明［6］相对于人群的单核苷酸多态性(SNPs)频率，在SNPs中存在有大量的eQTLs，这些eQTLs可以用于重复验证SNPs与复杂疾病以及某些药物表型的关联。

使用标准的QTLs定位方法检测eQTLs的表达差异和遗传多态性之间的关联，唯一需要特别强调的是，eQTLs研究可能涉及上百万个或更多微效性状的表达。虽然可以使用标准的基因定位软件包，但是，使用诸如QTL Reaper或基于Web的eQTLs定位程序Genenetwork的自定义代码包，计算速度往往更快。GeneNetwork有许多大型eQTLs定位数据库，并提供界面窗口，以快速计算定位单个eQTL位点和计算其上位相互作用。由于所有的QTLs定位研究是真实的，所以，在定位的最后一步，通常难以确定引起性状改变DNA变异。因此需要进行再次的重复性验证。特例的情况是trans-eQTLs，不像cis-eQTLs有强的先验概率可用，trans-e QTLs需要结合统计学、基因定位和生物信息学方法共同应用，来评估定位候选基因和整体表达差异的相互作用［7］。

全基因组关联(GWAS)研究方法的缺点，是无法获得和了解遗传变异影响被检测表型的机制，对于与复杂表型关联的多个微效到中效遗传变异，仅能够说明一定比例的检测表型的遗传度，而且很难证明这些遗传变异与所检测复杂表型的遗传度有明显相关关系［8］。在这种情况下，有两个主要问题:第一，明确遗传变异或遗传标记影响了哪些基因的功能;第二，发现随机突变，因为人类基因组连锁不平衡(LD)，使得人们寻找随机突变成为一个复杂的工作。所以，为了应对这两项挑战，获得可以解释特异性基因的单一变异影响基因功能的更多信息是必要的。例如，说明遗传变异对基因表达影响的方法之一，就是多变异可能产生的累积效应。因为在大多数的GWAS研究中发现，常见变异总是位于基因的非编码区［9］，这种累积效应逐渐被遗传学家视为至关重要。Gerrits A(2010)的研究显示，通过GWAS研究发现的eQTLs信号可聚类在淋巴母细胞上［5～10］，对细胞分化状态有高敏感性，因此，可以预计，当人们检测更多的组织和细胞类型时，也可能会重复这一模式(eQTLs)。

本文将探讨在基因表达和基因分型技术进步的推动下，针对不同的生物背景，进行eQTLs研究的设计如何能够检测调控变异的作用。在此将着重强调这些研究进展是如何拓展了人们对调控格局进一步的认识，以及通过揭示受基因调控的细胞类型和时空特异性的程度，来进一步拓展人们对基因调控框架的理解，从而进一步阐明人们如何应用这些信息去揭示从个体转录组到调控网络的不同复杂层面上，复杂性状的分子基础。最后，本文提出如何整合这些信息，并进而通过大规模检测细胞表型(如基因表达)和功能聚类，来帮助人们确定可预测疾病的生物标志物。

1.eQTL研究

1.1 设计和解释 eQTLs研究的设计和解释并不简单。目前eQTLs的研究主要包含四个重要参数:①基因组和转录组序列的精度;②细胞进化过程和状态;③人群结构;④特异性拟表型的精度。

1.2 通过NGS测序提高精度 通过二代测序(next generation sequencing，NGS)技术进行 mRNA全基因组测序(RNA-seq)，为研究mRNA的转换调控变异提供了一个有力的手段，RNA-seq不仅有高的转录组序列精度，也籍此可更好的识别获得eQTLs。例如，一项研究在60名欧洲人和69名非洲人队列中应用RNA-seq来筛查基因表达中的遗传差异［11，12］，RNA-seq技术大大提高了基因变异的识别能力，这些识别到的遗传变异包括了与转录组表达水平关联的基因元件和变异。

此外，检测到的基因型关联要与等位基因关联整合，因为对于每一个体来说，人们获得的信息为来自两个等位基因的转录组总体水平和相对水平，由于使用RNA-seq数据定位的是多个个体的杂合子，这就可以观察到罕见的遗传效应。所以，在多数情况下，这些效应不仅有整体表达的差异，而且还有转录终止和异构体表达中等位基因特异性的差异。现在随着大规模人群测序的日益普及，人们将需要新的统计方法来评估罕见的遗传变异，并同时找到有因果关系的调控变异。

1.3 细胞发展过程和状态 许多调控元件具有组织特异性，因此具有功能结局的序列变异在一定程度上表现为组织特异性效应。设计和解释eQTLs研究的困难，主要是由于基因调控的复杂性，包括基因调控的空间和时间上的复杂性。几项研究已经在不同组织中进行了eQTLs研究，并在不同组织和细胞类型之间做了eQTLs分析比较，结果表明:eQTLs需要在多个定义良好的细胞类型中进行检测，尤其是那些与特异性疾病表型相关的细胞类型［13］。为了采集调控变异的全方面生物效应，基因型－组织表达［Genotype-Tissue Expression(GTEx)project，GTEx］项目已开展了侧重许多不同组织的宏大研究计划，GTEx的目标是要识别和比较组织特异性的eQTLs，以达到更高的分辨组织和细胞类型的精度。

1.4 人群结构 任何遗传研究的精度或分辨率都取决于基因组变异的结构，这些结构变异在人群间实际差异很大［14］。对在不同人群中进行比较的结构和功能变异的分布和性质，应用遗传学进行基因表达研究已经卓有成效。尤其是在多人群样本研究中，应用传统物理定位克隆和重叠评估方法，及种群间不同的LD模式来精细定位共有变异的方法［15］。这些研究可以提供人们预测疾病风险的常见变异及其风险变异传递规律，这些结论将使人们能够从不同人群间获得共有变异功能效应的信息。然而，由于大部分eQTLs研究在很大程度上受限于参比样本数(如国际HapMap计划)，所以，必须整合不同人群数据来扩大样本数。

1.5 特异性表型 如果人们仅关心遗传信号的影响，而不考虑任何生活方式或环境变异的影响，那么，研究eQTLs最好要使用参比样本而不要使用疾病关联样本。因为使用参比样品可以使人们能够区分到底是因果效应导致的表型，还是个体出现表型后引起的反应性效应。虽然大部分疾病相关的常见变异仅简单的赋予疾病发病风险，但在细胞水平上却可能反映的是病例和对照中均有相同的效应。Moffat等精确地证明了这一点，他发现虽然哮喘的GWAS信号定位到ORMDL3基因的一个eQTL上，但病例组和对照组之间ORMDL3基因的表达均值没有显著性差异［16］。因此预计，一个常见的eQTLs变异在病变组织和健康组织有相同的效应。然而，随着人们对复杂疾病认识的不断提高，人们也要说明来自环境和表观遗传方面的作用。另外，直接对研究对象的复杂性状进行eQTLs研究可能会更说明问题。此外，虽然聚类信号通路中的遗传效应有些复杂，但是可对以前未知的因果关系加以说明。越来越多的研究致力于有良好表型的样本的基因表达，因此这类信息应该不久就可以利用。

1.6 基因调控的结构 eQTLs研究为人们提供了一个间接探索基因调控的功能格局，洞察影响基因表达的基因位置和功能序列效应模式的方法。尤其是，eQTLs研究已经阐明了调控变异的位置和作用，调控元件的组织特异性，以及顺式和反式作用改变在任何已知基因表达中的贡献。

1.7 eQTLs的位置和效应的大小 许多eQTLs的研究表明，有最强效应的eQTLs，最常见的位置是位于相应基因转录起始位点(TSS)附近 100 kb内［17，18］。这些发现意味着，eQTLs参与了RNA聚合酶Ⅱ的募集及作为调控结构的关键元件－转录因子结合位点，影响着随后的转录水平，而远端eQTLs作用元件影响较弱。由于远端元件的弱效应难以确认，到目前为止已经识别的大多数eQTLs变异与疾病发病风险没有因果关系的证据，虽然在LD区域中识别有因果变异的报道。正因为如此，那些潜在的因果变异，既可能位于远端，也可能位于多个组织属于条件－依赖的调控元件，或者位于转录物的外显子结构内。所以，通过在相同人群样本中发现条件－特异性eQTLs研究，可以检测eQTLs效应的大小和人群分布。

对T细胞、淋巴母细胞(LCLS)和成纤维细胞进行的组织特异性eQTLs研究的表明，跨组织的共有eQTLs更受限于TSS，且具有更大的效应。相比之下，散在分布的组织特异性eQTLs有更弱的效应［19］。这方面的证据表明，即使eQTLs位于TSS附近，遗传个体差异的效应对条件－特异性的调控序列的影响仍然要比对启动子或不同异构体共有外显子的影响(效应)小。

1.8 组织特异性 在eQTLs研究中的条件－特异性的差异，为人们针对不同生物背景，探查转录本的特异性提供了指标。条件特异性基因调控的典型模式说明基因组中存在有修饰基本转录的散在调控元件。然而，不同条件下eQTLs的共有程度，使人们能够估计组织间共有的调控元件和调控网络。由于 ENCODE(ENCyclopedia Of DNA Elements)项目［20］中检测到许多增强子具有组织－特异性，与发育距离较远的组织相比，说明具有相似分化谱系的细胞可能会有更多的共享eQTLs。然而，上述关于T细胞，LCLs和成纤维细胞的研究，报道约69%～80%的cis-eQTLs具有细胞－类型特异性，特别是密切相关的细胞类型，如LCLS和T细胞，有少量的共享cis-eQTLs［19］。这表明，在后期发育过程中，高频率功能变异可能起主要的作用。然而，由于人们对发育过程中调控元件的知识依然不完全明了，所以，通过对完整的调控元件分布和已发现的eQTLs元件进行比较，很难直接证明这一假设。

研究已经证明，任何一个共有eQTLs均可能有高度环境依赖和方法学依赖。例如，一项研究通过比较两种不同的组织，报导了血液和脂肪组织中共有cis-eQTLs＞50%［17］。与上述研究相似，另一项研究发现，在小鼠脂肪，脑，肝和肌肉组织中共有 cis-eQTLs＞ 50%［21］。

然而，一项独立研究，在四种造血细胞分化状态中发现1283个 eQTLs中只有365个共有eQTLs，表明eQTLs有细胞类型依赖性［22］。最近的一项研究视野更开阔，他们跨过简单的共有eQTLs研究，直接观察组织间表达量水平改变所产生的生物学效应表明，即便是同一个共有eQTL，也可能在不同组织之间的表达量有统计学显著性差异，可能有相当大的差异，从另一方面来说这也代表了重要的组织特异性［23］。

所有上述方法都有不同的设计、power和分析参数，但总的结论是，调控效应有很明确的组织特异性，且变异会影响这些调控效应。通过利用共享eQTLs及特异性eQTLs模式，人们能够不断增加对基因调控路径的了解，并确定环境特异性的调控序列的位置。

1.9 Trans和cis效应 通过eQTL研究去检测trans-调节作用能够补充人们对cis-调控结构的了解(在本文中，采用了基于距离的trans和cis的常规表述［24］)。这种方法的优点是，提供人们理解影响远端基因表达和结构基因的遗传差异影响靶基因表达的因果关系，同时提供人们理解靶基因表达特异性蛋白产物的生物学意义。一些研究通过评估受trans-效应或cis-效应影响基因表达的比例，成功的评估了不同效应类型的重要性［25～27］。大多数研究结果一致认为，transeQTLs比cis-eQTLs的效应更弱。最近的研究表明，这一观点是有争议的，尽管trans-eQTLs的效应较低，但是，trans-eQTLs的累积却可以解释更多的表达遗传度［25，28］。虽然怀疑transeQTLs的影响，但是trans-eQTLs的因果效应正在积极探索中。也许最好的假设是，trans-eQTLs在转录因子基因之外应该是丰富的存在的。然而，这种关系没有被明确观察到［29］。有越来越多的证据表明，这些trans-eQTL基因能够通过介导某一转录因子发挥效应，而不是直接编码某种转录因子［25，30］。

假定潜在的trans-eQTLs是复杂的，那么组合eQTLs数据寻找调控路径似乎是可靠的。如，一项研究利用eQTLs数据，发现和证实了细胞周期蛋白H(CCNH)和氧化磷酸化的新关系［31］。另一研究发现了人类和小鼠中与肥胖表型相关脂肪组织的核心调控网络［17］。一补充研究应用基因共表达获得的调控网络，观察到了鼠体重相关“block-QTLs”的富集［32］。除此，许多基本的系统-生物学-技术也在应用eQTL s数据对调控路径进行分类［33～35］。应用这种技术将不断地阐明新的转录因子复合物和基因调控的路径。

通过测序了解，RNA-seq对研究eQTLs是颇为重要的，首先，它能够为人们提供等位基因特异性表达信息，这是基因表达微阵列方法无法提供的。此外，它还能为人们研究RNA亚型提供强大的数据支持，从而使人们进一步了解基因调控格局的新前景，同时也强调了 cis和 trans复杂的转录模式［36，37］。RNA-seq的精度，允许人们详细研究影响基因表达的遗传变异和特异性功能组件。其实，很多eQTLs的形成是由于转录终止过程中的基因差异和剪接变异［11，38］。使用来自RNA-seq的特异性等位基因的表达信息，识别特异性单倍型或特异性亚型的表达模型。通过基因表达微阵列的方法进行的重复研究，支持以前的研究结果:一个基因的eQTLs数量与其已知的转录亚型的数量相关［19］。此外，通过整合来自RNA-seq和连锁分析的特异性等位基因表达已经证明，transeQTLs能以不同的方式影响靶基因，且只有20%的trans-调节因子有等位基因失衡［25］。

基于测序的其他工具也有助于人们对遗传学中基因调控的理解。如应用染色质免疫沉淀结合DNA测序(ChIP-seq)进行的家族性的转录因子研究，很可能带来一个新的eQTLs的设计方法，这种方法不仅整合了表达水平的差异，同时也整合了不同转录因子和表观遗传标记的遗传差异［39］。随着对基因调控和基因表达认识的不断提高，遗传变异的功能效应及其对生理(尤其是疾病)性状的影响将会越来越明晰。

2.整合eQTLs和GWAS研究

最后，人们想用eQTLs的数据来解释GWAS研究信号，同时阐明GWAS信号潜在的特异性生物效应。这种方法已得到了一些研究证实。如Dubois等［40］发现与腹腔疾病关联的风险变异的38个位点中有20个也与附近一个基因的表达变化紧密关联。在一项25万人的BMI分析中，多个组织eQTLs分析得到的32个位点中，有14个与特异性候选基因连锁［41］。最后，在偏头痛的遗传分析中，与候选基因表达相关的基因型提示了偏头痛这一性状的基本调控机制［42］。这类与疾病关联的基因变异和eQTLs之间有意义的相关关系，为选择候选基因和探索不同疾病的发生机制提供了依据。

表1 与疾病/性状关联的eQTL基因和组织特异性表达之间的关系

3.未来的方向

尽管，eQTLs的研究进展，不断提供人们基因调控的结构，并且能够让人们把遗传变异和重要的生理性状联系起来，而且，许多研究已经开始把细胞性状(主要是表达)和疾病性状联系起来，但是未来机制研究的挑战依然严峻。

3.1 从细胞到疾病性状 首先，鉴于检测到的共有eQTLs，随细胞类型和生物性状的不同而不同，环境－特异性的发现，可能会影响人们把细胞水平的遗传效应和疾病相关性状联系起来的能力。因此，需要进一步实施对相关组织疾病关联性状的病因学研究。这就要求人们利用技术进步，如利用诱导多能干细胞(iPSCs)技术获得较难得到的细胞类型［62］。另一种解决方案可能是应用疾病关联模型系统组分的模式生物的工程细胞或通过分子遗传学的方法，可使人们通过使用外源因子激活相关路径或在外部环境激活相关路径的方法，能够研究罕见细胞类型的调控网络。

3.2 个体转录组 另一大的挑战是要阐明因果变异。大规模人群的基因组测序使影响表达性状的遗传变异的精度达到了前所未有的程度，从而使得获得这些因果变异成为可能［63］。基于功能基因组测序的工具，如 RNA-seq和 ChIP-seq，结合全基因组测序不仅可以发现特异性因果变异，还能够发现与此相关的任何功能信息。这有助于推断新变异的效应。联合检测的信息:即，整合多个变异和环境影响的表达谱的数据，以及整合来自基因组的数据，可能比任何单一方法会更好的帮助人们确定疾病风险和开展后续治疗。例如，这些信息会说明在调控变异和蛋白质编码变异之间的上位相互作用，并解释是否有调节疾病－诱发变异的效应，进而可以阐明外显模式的差异。此外，eQTLs的研究和应用，尤其是与药物代谢密切相关的肝组织eQTLs的研究，可以为药物基因组学提供更广阔的视野，来证实中人群中不同药物敏感性的遗传决定因素和基因表达特征，指导药物基因组学的研究，最终实现个体化治疗［64，65］。

总之，eQTLs研究显示，将来的临床不是基于独立的个体基因组(即基因组测序)，而是基于整个个体“组学”，它将联合DNA和功能基因组学的深度分析，告诉人们更多的个体医学信息。

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