贺延新，刘素玲

(广东省深圳市平乐骨伤科医院，广东 深圳 518000)

普卢利沙星(NM441)是噻丁啶－喹啉羧酸衍生物(NM394)的脂溶性前体药物，口服易吸收并水解成NM394，NM394选择性分布于菌体内，抑制细菌DNA螺旋酶的活性，从而发挥广谱抗菌作用，但NM394口服吸收较差[1]。NM394作为NM441的合成母体及降解产物，因此有必要控制产品中NM394的量，以保证普卢利沙星产品的质量。本试验中采用反相高效液相色谱(RP－HPLC)流动相梯度洗脱法测定普卢利沙星中NM394含量及其他有关物质。

1 仪器与试药

日本岛津LC－2010AHT型高效液相色谱仪;FA2004型电子天平(上海精密科学仪器有限公司);CSB6L－1800型超声波清洗器(天津考德斯科技有限公司);AD－DI30(UV)型超纯水系统(上海讯辉环保科技有限公司)。普卢利沙星对照品(纯度为99．4%)、NM394对照品(天津市汉康医药生物技术有限公司，含量为99．6%);普卢利沙星片(批号为 090720，090721，090722，广州白云山制药股份有限公司)，规格为100 mg普卢利沙星相当于NM394 100 mg;乙腈、三乙胺为色谱纯，水为超纯水，磷酸二氢钠为分析纯。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱:Phenomenex C18柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm);流动相:A为0．025 mol/L磷酸二氢钠溶液(用三乙胺调pH至6．0)，B为乙腈，用流动相A－B(80∶20)洗脱至NM394的峰完全检出约6 min，即换流动相A－B(60∶40)洗脱至普卢利沙星峰保留时间的 3 倍;流速:1．0 mL/min;检测波长:276 nm;进样量:20 μL。

2．2 溶液制备

取本品20片，研细，精密称取适量(约相当于普卢利沙星50 mg)，置100 mL容量瓶中，加流动相B 50 mL，超声处理5 min使溶解，加流动相A－B(60∶40)稀释至刻度，摇匀、过滤，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1 mL，置100 mL容量瓶中，加流动相A－B(60∶40)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取NM394对照品适量，精密称定，用流动相A－B(80∶20)溶解并稀释成每1 mL中约含2 μg的溶液，作为NM394对照品溶液。

2．3 方法学考察

辅料干扰试验:取处方量的辅料适量，置100 mL容量瓶中，用流动相A－B(60∶40)溶解并稀释至刻度，滤过，量取续滤液，作为阴性对照溶液，依法进样20 μL。结果见图1A。

NM394与普卢利沙星对照试验:取NM394、普卢利沙星对照品各适量，置100 mL容量瓶中，按2．2项下方法配制NM394对照溶液、阳性对照品溶液。取普卢利沙星片0．12 g，依法制成供试品溶液。取以上各溶液，依法进样20 μL。结果见图1B和图1C。

破坏试验:称取本品细粉约0．12 g共3份，分别置100 mL容量瓶中，加入0．5 mol/L盐酸溶液1 mL，放置1 h后依法测定(酸破坏);加入0．1 mol/L氢氧化钠溶液1 mL，放置1 h后依法测定(碱破坏);加入(1→10)双氧水1 mL，放置10 min后依法测定(氧化破坏)。取本品适量，在(4 500±500)lx下光照10 d后，研细，取细粉约0．12 g，置100 mL容量瓶中，依法测定(强光破坏)。取本品适量，在105℃放置8 h后，研细，取细粉约0．12 g，置100 mL容量瓶中，依法测定(热破坏)。破坏试验色谱图见图2。

线性关系考察:精密称取NM394对照品适量，用流动相AB(80 ∶20)溶解，配成 0．24 g/L 的溶液，分别精密吸取 0．5，1．0，2．0，4．0，8．0，12．0 mL，置 100 mL 容量瓶中，用流动相 A － B(80∶20)稀释至刻度，摇匀。按测定方法进样20 μL，以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标进行线性回归，回归方程为 Y=4 450．4 X －5．220 7，r=0．999 1(n=6)。结果表明，NM394 质量浓度在1．2～28．8 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

图1 辅料干扰与对照试验色谱图

图2 破坏试验色谱图

最低检测限确定:精密称取NM394和普卢利沙星对照品适量，分别用流动相A－B(80∶20)和流动相A－B(60∶40)溶解配制成 0．43 μg/mL 和 0．22 μg/mL 的溶液，进样 20 μL，观察主成分峰高度。当信噪比为3∶1时，计算得NM394、普卢利沙星最低检测限量分别为 6．3 μg 和 2．8 μg。

溶液稳定性试验:取2．2项下供试品溶液，分别放置0，2，4，6，8 h后，取样测定NM394及其他杂质含量。结果表明，NM394及其他杂质含量与初始溶液相比无明显变化，没有降解产物出现，供试品溶液在8 h内基本稳定，RSD分别为1．7%和0．8%。

NM394回收率试验:取处方量本品辅料约0．11 g，共9份，分别置100 mL容量瓶中。取NM394对照品约20 mg，置500 mL容量瓶中，加流动相A－B(80∶20)溶解并稀释至刻度，摇匀;分别精密吸取4，5，6 mL各3份，分别加入9个辅料溶液容量瓶中，用流动相A－B(60∶40)溶解稀释至刻度，制成80%，100%，120%浓度的供试品溶液;量取20 μL，依法进样。结果低、中、高浓度回收 率 分 别 为 98．8% ，99．7% ，99．4% ，RSD 分 别 为 0．99% ，0．61% ，0．43% 。

供试品溶液浓度与有关物质测定结果相关性考察:称取本品细粉适量，精密称定，共3份(各约相当于普卢利沙星25，50，100mg)，分别置100 mL容量瓶中，依法测定。结果有关物质分别为0．34% ，0．36% ，0．35% ，RSD 为 2．8% 。溶液 的质量浓 度在0．25～1．0 g/L间与有关物质的含量有良好的相关性。

重复性试验:称取本品细粉约0．12 g，精密称定，共6份，依法测定。结果NM394含量的 RSD为0．89%，表明方法重复性良好。

2．4 样品含量测定

取3批样品，依法测定。结果3批样品中NM394含量分别为0．05% ，0．04% ，0．08% ，有 关 物 质 含 量 为 0．36% ，0．37% ，0．37%，表明NM394及有关物质均在限度内。

3 讨论

普卢利沙星为脂溶性化学物质，在流动相中极易降解生成水溶性的NM394[3];因此溶解NM394的溶剂选流动相A－B(80∶20)，溶解样品的溶剂选流动相A－B(60∶40)。二者所选的溶剂目前虽无法统一，采用2种溶剂，但可以保证样品测定结果的稳定。

由色谱图(图1及图2)可知，辅料无吸收峰，因此辅料对NM394及其他有关物质的测定无干扰;本品经酸、碱、氧化、强光、高温条件的破坏试验后，产生的杂质峰与主成分峰、NM394峰在本色谱条件下能够有效分离，分离度符合要求。因此，该色谱系统测定本品中NM394及其有关物质的专属性较强，可采用梯度洗脱法测定NM394及其他有关物质。

在普卢利沙星的测定色谱条件下，NM394成分的保留时间较短(几乎无保留)，容易被系统产生的色谱峰干扰，所测NM394结果不稳定[2]。采用流动相梯度洗脱，NM394保留时间延长;主成分峰、NM394峰及其他各杂质峰均能有效分离，且分离度良好、专属性较强、准确度高。因此，本色谱系统能够准确测定普卢利沙星中的NM394和有关物质。

[1]Ozaki M，Matsuda M，Tomii Y，et al．In vivo evaluation of NM441，a new thiazeto －quinoline derivative[J]．Antimicrob Agents Chemother，1991，35(12):2 496－2 499．

[2]初 虹．HPLC法检查普卢利沙星有关物质[J]．药学进展，2004，28(9):424－427．

[3]程秀民，马淑涛，尘学兰，等．普卢利沙星的HPLC测定[J]．中国医药工业杂志，2004，35(11):682 －683．