孙稳，丁国富，王勤章

（1石河子大学医学院,石河子832000；2石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科，石河子 832000）

泌尿系结石是最常见的泌尿外科疾病之一，由多因素共同作用所致，其病理机制目前尚不明确。研究表明：尿钙排泄增高是诱发或促进含钙尿路结石的形成的一个重要危险因素[1]。Claudin-14为紧密连接蛋白家族的一员，在正常肾脏中不表达，只有在异常情况下才表达，且严格定位于肾脏的髓袢升支粗段（thick ascending limb，TAL）[2]，可通过降低细胞旁途径的紧密连接蛋白-16和紧密连接蛋白-19构成的阳离子通道渗透性抑制肾小管对钙的被动重吸收[3-5]，从而促进尿钙排泄。全基因组关联性研究也显示[6]：Claudin-14基因与高钙尿肾结石的发生显著相关。

由此我们推测，在结石肾组织中Claudin-14可能通过促进尿钙排泄参与结石的形成。

本实验旨在通过构建大鼠肾草酸钙结石模型初步探讨Claudin-14在肾草酸钙结石大鼠肾组织中的表达变化及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1主要试剂和仪器

乙二醇（Sigma，美国），氯化铵（Sigma，美国），兔抗 Claudin-14抗体（Santa Cruz，美国），山羊抗兔二抗lgG（北京中山金桥，中国）。

Au1000自动生化分析仪 （Olympus，日本），180-80型原子吸收分光光度计（Hitachi Limited，日本），PCR 仪（TaKaRa，日本），mini垂直电泳槽，半干式转印系统（Bio-rad公司，美国）。

1.1.2实验分组和大鼠肾结石模型的构建

参照曹正国等[7]的方法制作大鼠肾结石模型。选用8周龄S-D雄性大鼠30只 （购于新疆医科大学动物实验中心），SPF 级，体重（200±20）g。

将大鼠随机分为2组（n=15），对照组：自来水饮水，每日每只2 mL生理盐水灌胃；结石组（n=15）：含1%乙二醇自来水自由饮水，每日每只2 mL 2%氯化铵灌胃。实验大鼠适应性饲养3 d，连续灌胃4周。

1.2 方法

1.2.1大鼠24 h尿钙含量检测

实验第28天收集实验大鼠24 h尿液，应用全自动生化分析仪进行24 h尿钙含量测定。

1.2.2肾组织HE染色

连续灌胃4周后水合氯醛麻醉处死实验大鼠，手术切取左肾，福尔马林溶液固定，石蜡包埋后切片行常规HE染色，普通光学显微镜下观察肾组织形态学变化及肾小管区有无结石结晶，以判断肾结石模型是否成功建立。

1.2.3 RT-PCR法检测肾脏组织中的Claudin-14 mRNA的表达

按Trizol法提取肾组织总RNA。紫外分光光度计测定提取的RNA A260/A280均为1.8-2.0，用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳确定RNA纯度。

将Trizol试剂提取的RNA反转录为cDNA后进行Claudin-14和GAPDH基因的PCR检测。

Claudin-14 上 游引物 序列：5’-GACGAGGTGACTTCTCTGGC-3’；

下 游 引 物 序 列 ：5’ -ACACACCCTCTAGTGCAGGC-3’。

产物大小为242 bp，反应条件为：95℃5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共 35 个循环，72℃10 min。

GAPDH 上游引物：5’-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3’；

下 游 引 物 ：5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。

产物大小为496 bp，反应条件为：95℃5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 35 个循环，72℃10 min，取4 μL PCR产物加1 μL的溴芬蓝进行琼脂糖凝胶电泳观察，并用Bio-rad凝胶成像分析系统分别计算Claudin-14 mRNA和GAPDH mRNA的积分光密度值。

1.2.4 Western-Blotting法检测肾脏组织Claudin-14蛋白的表达

取100 mg肾脏组织低温研磨后，加入PMSF及蛋白裂解液 （1∶100）， 冰上放置 40 min，4 ℃下13300 r/min离心40 min后取上清。以BSA为标准，用Bradford法对上清进行蛋白定量。

取 40 μg蛋白样品，10%SDS-PAGE 电泳，半干转至硝酸纤维素膜，37℃封闭液中封闭 2 h；Claudin-14 抗体 （1∶500），4℃下孵育 12 h。 次日用TBST洗膜 20 min×3次， 加入相应的二抗 （1∶20000）， 室温下孵育2 h，TBST洗膜20 min×3次，ECL化学发光试剂显色，显影定影处理，获取实验结果，Quantity one软件分析图像。

实验以β-actin蛋白条带为内参照，结果用靶蛋白/β-actin的比值表示。

实验采用TBS-T液代替Claudin-14抗体孵育作为阴性对照。

1.3 统计学处理

采用Sigmstat 3.5统计软件进行分析，计量数据均用均数±标准差（S）表示，组间比较采用 t检验，相关分析采用Pearson Correlation，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 24 h尿钙排泄量

两组比较，结石组24 h尿钙排泄量显著高于对照组，分别为：（9.66±1.10）和（3.26±0.60）mmol，组间差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 形态学观察结果

肉眼可见结石组大鼠肾组织肿胀，表面点状分布黄白色结晶或钙化（图1）。

图1 大鼠肾脏外观变化Fig.1 Appearance change of the kidney in rats

HE染色，普通光学显微镜下观察发现结石组大鼠肾组织多数肾小管管腔内弥漫散布无色透明、片状结晶，皮质多于髓质，主要位于近曲小管和远曲小管。肾小管上皮细胞明显肿胀、变性、坏死，管腔内可见嗜伊红样坏死物质及部分脱落上皮细胞，肾间质有炎性细胞侵润（图2B）。对照组无上述病理改变（图2A）。

图2 大鼠肾组织光镜下观察（HE×200）Fig.2 The rats renal tissue were observed under light(HE×200)

2.3 RT-PCR检测肾组织Claudin-14 mRNA结果

结石组Claudin-14 mRNA显著高于对照组，凝胶成像系统扫描灰度值显示Claudin-14 mRNA相对表达含量在对照组和结石组中分别为0.039±0.007和0.128±0.006，组间差异有统计学意义 （P＜0.01）（图 3）。

图3 大鼠肾组织Claudin-14mRNA/GAPDH电泳结果分析Fig.3 The result analysis of Claudin-14 mRNA/GAPDH in rat kidney tissue

2.4 Western-Blotting检测肾组织Claudin-14蛋白结果

结石组Claudin-14蛋白与对照组相比显著增高，对照组未见表达，组间差异有统计学意义（P＜0.01）（图 4）。

图4 2组大鼠肾组织Claudin-14蛋白Western-Blotting检测结果Fig.4 Expression of Claudin-14/β-actin in rat kidney tissue by Western-Blotting

2.5 Claudin-14蛋白表达与24h尿钙排泄相关性分析

结石组大鼠肾组织中Claudin-14蛋白相对表达量与24 h尿钙呈正相关，r=0.747，组间差异有统计学意义（P＜0.01），因对照组未见Claudin-14蛋白表达，故未做相关性分析。

3 讨论

泌尿系结石的发生由多因素共同作用所致。有研究显示：高钙尿症与含钙结石的发生显著相关[8]。众所周知，尿钙水平取决于肾小球对钙的滤过与肾小管对钙的重吸收，肾小管对钙的重吸收包括主动重吸收和被动重吸收，被动重吸收的钙量约占总重吸收钙量的85%，主要通过近曲小管和髓袢升支粗段（TAL）的细胞旁途径进行[9]，这间接说明细胞旁途径在尿钙排泄过程中扮演着重要角色。

紧密连接主要存在于上皮细胞、内皮细胞间的连接复合体中，可使相邻细胞膜紧靠在一起，形成围绕细胞的物理屏障结构，具有封闭上皮细胞间隙，防止可溶性物质从细胞一侧扩散到另一侧的屏障功能，同时把上皮细胞分成顶端的脂质成分和基质的蛋白质成分两个不同的功能区[10]。Claudin-14作为紧密连接蛋白家族的一员，是构成TAL细胞旁途径的的重要组成蛋白[3-5]。Elkouby-Naor L等[11]研究显示在给予Claudin-11/Claudin-14双基因敲除小鼠高钙饮食时，小鼠出现了高镁血症、低镁尿症，尿钙没有出现增高反而出现了降低，这提示Claudin-14可能在肾脏钙离子的排泄过程中发挥重要作用。

本实验通过RT-PCR及Western-Blotting从不同层面首次证实：在结石组大鼠肾组织中claudin-14存在表达，且结石组claudin-14表达显著高于对照组。通过对两组大鼠24 h尿钙检测发现：结石组尿钙排泄显著高于对照组，且尿钙排泄量与claudin-14蛋白表达量存在正相关。由此，我们推测：claudin-14参与肾结石形成可能是通过增加尿钙排泄发挥重要作用，其可能机制：claudin-14高表达下调细胞旁途径的紧密连接蛋白-16(Claudin-16)和紧密连接蛋白-19(Claudin-19)构成的杂聚肽阳离子通道渗透率抑制肾小管对钙的重吸收[3-5]，从而参与高尿钙性肾结石的形成。

我们的实验同时也发现一个有趣的现象，Claudin-14 mRNA在对照组和结石组肾组织均有表达，且结石组上调显著高于对照组，相反，Claudin-14蛋白在结石组显著增高，而在对照组却几乎检测不到，故我们推测在体内Claudin-14可能受某种影响因素调控。有研究显示[12]：正常钙或低钙饮食时，Claudin-14转录和翻译水平被两个microRNAs抑制 （miR-9和 miR-374）， 这两个microRNAs以协同的方式直接作用于Claudin-14 mRNA的3，-UTR，促使Claudin-14 mRNA衰退，进而抑制其翻译成蛋白；当给予一个高钙饮食时，Claudin-14转录和翻译水平显著增高，研究中也发现低钙饮食时，miR-9和miR-374显著上调，而在高钙饮食时，miR-9和miR-374显著下调。相似的研究也显示[13]：在通过给予MKTAL细胞高钙时（3 mM Ca2+），这两个microRNAs被最大限度的抑制，Claudin-14 mRNA及蛋白表达均显著上调。我们的实验结果与国外研究结果相符。即TAL可能确实存在一种可调控Claudin-14 mRNA转录、翻译的microRNAs，同时，有学者发现microRNAs可能受细胞外钙敏感受体（CaSR）调节，CaSR作为一种G蛋白偶联受体在钙稳态方面起着重要作用[14-15]，在肾脏中有调节尿钙排泄的作用[16]。由此，我们推测：Claudin-14表达增高促进尿钙排泄可能受CaSR-microRNAs通路调控，但具体调节机制还有待下一步研究。

本实验研究结果有利于充实对高尿钙性含钙肾结石的发病机制的认识，为泌尿系结石预防和治疗的相关研究提供新的思路和靶点。

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