薛春霞　董社英

摘要：利用紫外吸收光谱法研究了头孢地尼（CDR）、克林霉素（CLMC）、罗红霉素（RM）和卡那霉素（KLMC）4种抗生素类药物与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用，并对其结合反应机理进行初步探讨，同时以CDR分子为基体研究了BSA对药物分子的影响。结果表明，在人体生理pH值试验条件下CDR、CLMC、RM及KLMC与BSA的结合常数分别为1.02×105、1.24×104、1.38×103、1.04×103 L/mol，用Scatchard拟合法求得CDR与BSA的结合常数为0.88×105 L/mol，两种方法结果基本一致。

关键词：牛血清白蛋白；克林霉素；罗红霉素；卡那霉素；头孢地尼；紫外吸收光谱法

中图分类号：O657.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）16-3855-04

Abstract： The interactions between bovine serum albumin（BSA） and four antibiotics including Cefdinir（CDR）， clindamycin（CLMC）， roxithromycin（RM）， Kalamycin（KLMC）were analyzed with UV absorption spectrometry. The binding mechanism was discussed. The effect of BSA on CDR molecule was studied. The results showed that the binding constants of CDR–BSA， CLMC-BSA， RM-BSA and KLMC-BSA under physical pH were 1.02×105， 1.24×104， 1.38×103 and 1.04×103 L/mol， respectively. The result of CDR-BSA obtained from Scatchard fitting method was 0.88×105 L/mol， similar to that from the Lineweaver-Burk method.

Key words： bovine serum albumin（BSA）； clindamycin；roxithormycin； kalamycin； cefdinir； UV absorption spectroscopy

血清白蛋白是血浆中一种重要的运输蛋白，当药物分子进入人体后，通过血浆的贮存和运输，达到受体部位发生药理作用。药物与血清白蛋白在体内可产生不同程度的结合，这种结合将影响药物的配置及药理作用，对药效学和药动力学起着重要的作用[1]。因此，血清白蛋白与许多药物的相互作用研究已逐渐成为化学、生命科学和医药学等学科研究领域中活跃的热点之一[2-4]。

所研究的4种抗生素头孢地尼（Cefdinir，CDR）、克林霉素（clindamycin，CLMC）、罗红霉素（roxithromycin，RM）及卡那霉素（Kalamycin， KLMC）均具有广谱抗菌性，其结构如图1所示。本试验首先以BSA为基体，在人体生理pH值条件下研究CDR对BSA紫外光谱的影响，利用Lineweaver-Burk双倒数法测定了各抗生素药物分子与BSA间的结合常数等重要相互作用信息。在此基础上，又以CDR分子为基体，研究BSA对CDR紫外光谱的影响，用Scatchard拟合法求得两者之间的结合常数并与Lineweaver-Burk双倒数法的结果进行比较，从不同角度为生命科学研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Nicolet Evolution 300型紫外-可见分光光度计（英国）；IX–501A型pH计（北京大学化学系）；Z-SJ60-4型电子分析天平（沈阳龙腾电子秤量仪器有限公司）。

BSA（上海国药集团化学试剂有限公司）：分子质量以67 000 Da计，1.0×10-4 mol/L 标准储备溶液，4 ℃冰箱保存，用时适当稀释；2.0×10-3 mol/L的CDR、CLMC、RM及KLMC（中国药品生物制品检定所）标准储备溶液，用时适当稀释；pH 7.4的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液；其他试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

将一定量的BSA与各抗生素溶液依次加入到10 mL比色管中，用pH 7.4的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液稀释至刻度，振荡均匀，静置15 min，用相应的缓冲溶液作参比，在190～320 nm波长范围内分别测定蛋白质及其与各抗生素混合溶液的紫外吸收光谱。

将一定量的CDR及其与BSA混合溶液依次加入到10 mL比色管中，用pH 7.4的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液稀释至刻度，振荡均匀，静置15 min，用相应的缓冲溶液作参比，在190～320 nm波长范围内分别测定CDR及其与BSA混合溶液的紫外吸收光谱。

2 结果与分析

2.1 CDR、RM、CLMC、KLMC对 BSA的紫外吸收光谱影响

在所选择的试验条件下BSA在紫外光谱区显示两个特征吸收带。其中206.0 nm处的特征吸收峰主要由肽键上C=O基的π-π*跃迁引起，与BSA分子的α-螺旋含量有关[5]；而278.0 nm处的特征吸收峰主要由BSA分子中肽链上的2个色氨酸残基的吲哚环和19个酪氨酸残基的芳杂环的π-π*跃迁所引起[6]。CDR、RM对BSA紫外吸收光谱的影响如图2所示，当固定cBSA 为4.0×10-6 mol/L时，随着加入CDR浓度的增加，BSA在278.0 nm处的吸收呈现明显的增色效应，最大吸收峰位发生红移；而加入一系列不同浓度的RM溶液时，随着RM浓度的增加，BSA在278.0 nm处的吸收呈现明显的减色效应，最大吸收峰位几乎不发生移动，CLMC、KLMC对BSA 278.0 nm处吸收的影响与RM相似。endprint

比较4种抗生素的结构（图1）可知，CDR结构中含有羧基，容易解离，当CDR的浓度逐渐升高时，离子诱导BSA分子发生类似于降低pH所出现的蛋白质肽链伸展现象[5]，使包围在BSA分子内部的色氨酸和酪氨酸残基的芳杂环疏水基团裸露出来，从而使278.0 nm吸收峰的吸收增强，同时使疏水基团之间的疏水作用增强、吸收峰红移；而RM、CLMC、KLMC分子中的多个羟基与BSA肽链中的氨基酸残基中的含氧或含氮基团之间可形成氢键，从而使氨基酸残基中含氧或含氮基团原有的键强减弱而引起其吸收峰吸光度值的降低[7]。

2.2 CDR、CLMC、RM、KLMC与BSA的结合反应

紫外吸收光谱可以用来测定药物分子与蛋白质的结合常数，药物分子与蛋白质的结合可以表示为[8]：

2.3 BSA对CDR紫外吸收光谱的影响

为了进一步了解4种抗生素与BSA的相互作用信息，现以各抗生素为基体，研究BSA对其紫外光谱的影响。由于RM、CLMC与BSA本身的吸收峰有部分重叠，其相互作用的研究受到干扰；而KLMC在紫外吸收区没有吸收峰；故本研究仅考察BSA对CDR药物分子紫外吸收光谱的影响。

在所选择的试验研究条件下，CDR在紫外区的3个吸收峰分别为203.0 nm、224.0 nm和286.0 nm。试验研究表明，BSA与CDR发生相互作用在286.0 nm表现最为明显，所以选择286.0 nm处的吸收峰为主要研究对象。固定CCDR = 4.0×10-5 mol/L，随着加入BSA浓度的增加，CDR的吸收呈现明显的增色效应，最大吸收峰位蓝移，由于286.0 nm的吸收峰由CDR中C=O基的n-π*跃迁引起，因此表明BSA与CDR的C=O有明显的相互作用，但更具体的位置有待进一步研究。

根据Scatchard模型方程[9]，以ΔA对ΔA/CBSA作图，由拟合直线的斜率可以求得结合常数KA。CDR能满足Scatchard拟合，其拟合的线性程度较好（图5）。线性回归方程为y=0.156 1+11.43x，r= 0.981，求得相互作用结合常数为0.88×105 （mol/L）-1。与用Lineweaver-Burk双倒数曲线求得BSA与CDR的结合常数相符。

3 小结

本研究利用紫外吸收光谱详细研究了BSA与CDR、CLMC、RM和KLMC相互作用。结果表明，BSA与CDR、CLMC、RM和KLMC均发生了结合作用；CDR与BSA之间存在疏水作用，而CLMC、RM、KLMC与BSA之间主要通过氢键作用结合，并由Lineweaver-Burk双倒数曲线求得CDR、CLMC、RM和KLMC与BSA的结合常数分别为：1.02×105、1.24×104、1.38×103、1.04×103 L/mol。同时以CDR为基体，研究BSA对CDR紫外光谱的影响，用Scatchard 拟合法求得结合常数为0.88×105 L/mol，两种方法结果接近。

参考文献：

[1] 田 媛，陈艳华，毕淑云，等.表面等离子体子共振传感器研究头孢菌素类药物与白蛋白的相互作用[J].分析化学，2006，34（7）：967-970.

[2] 刘家琴，田建袅，谢建平，等.厚朴酚与人血清白蛋白的相互作用研究[J].分析化学，2006，34（3）：557-560.

[3] 陈晓波，康栋国，李 崧，等.利福平与人血清白蛋白作用的荧光光谱[J].光谱学与光谱分析，2006，26（4）：674-677.

[4] 李桂芝，刘永明，虢新运，等.荧光法研究盐酸拓扑替康、盐酸依利替康喜树碱类药物和牛血清白蛋白的相互作用[J].化学学报， 2006，64（7）：679-685.

[5] 常希俊，黄 艳，贺 群.铱（Ⅳ）离子与人血丙种球蛋白的作用研究[J].化学学报，2005，63（3）：223-228.

[6] 张朝红，臧树良，耿 兵.三苯基锡化合物与牛血清白蛋白作用光谱[J].应用化学，2005，22（5）：489-493.

[7] 冯玉英，吴晓红，周家宏.竹红菌甲素与血红蛋白相互作用光谱[J].应用化学，2005，22（8）：895-898.

[8] 刘 媛，谢孟峡，康 娟.三七总皂甙对牛血清白蛋白溶液构象的影响[J].化学学报，2003，61（8）：1305-1310.

[9] 何 梅，夏之宁，阴永光，等.紫外光谱研究中药大黄有效成分与牛血清白蛋白的相互作用[J].中国现代应用药学杂志，2004，21（6）： 429-432.

（责任编辑 程碧军）endprint

比较4种抗生素的结构（图1）可知，CDR结构中含有羧基，容易解离，当CDR的浓度逐渐升高时，离子诱导BSA分子发生类似于降低pH所出现的蛋白质肽链伸展现象[5]，使包围在BSA分子内部的色氨酸和酪氨酸残基的芳杂环疏水基团裸露出来，从而使278.0 nm吸收峰的吸收增强，同时使疏水基团之间的疏水作用增强、吸收峰红移；而RM、CLMC、KLMC分子中的多个羟基与BSA肽链中的氨基酸残基中的含氧或含氮基团之间可形成氢键，从而使氨基酸残基中含氧或含氮基团原有的键强减弱而引起其吸收峰吸光度值的降低[7]。

2.2 CDR、CLMC、RM、KLMC与BSA的结合反应

紫外吸收光谱可以用来测定药物分子与蛋白质的结合常数，药物分子与蛋白质的结合可以表示为[8]：

2.3 BSA对CDR紫外吸收光谱的影响

为了进一步了解4种抗生素与BSA的相互作用信息，现以各抗生素为基体，研究BSA对其紫外光谱的影响。由于RM、CLMC与BSA本身的吸收峰有部分重叠，其相互作用的研究受到干扰；而KLMC在紫外吸收区没有吸收峰；故本研究仅考察BSA对CDR药物分子紫外吸收光谱的影响。

在所选择的试验研究条件下，CDR在紫外区的3个吸收峰分别为203.0 nm、224.0 nm和286.0 nm。试验研究表明，BSA与CDR发生相互作用在286.0 nm表现最为明显，所以选择286.0 nm处的吸收峰为主要研究对象。固定CCDR = 4.0×10-5 mol/L，随着加入BSA浓度的增加，CDR的吸收呈现明显的增色效应，最大吸收峰位蓝移，由于286.0 nm的吸收峰由CDR中C=O基的n-π*跃迁引起，因此表明BSA与CDR的C=O有明显的相互作用，但更具体的位置有待进一步研究。

根据Scatchard模型方程[9]，以ΔA对ΔA/CBSA作图，由拟合直线的斜率可以求得结合常数KA。CDR能满足Scatchard拟合，其拟合的线性程度较好（图5）。线性回归方程为y=0.156 1+11.43x，r= 0.981，求得相互作用结合常数为0.88×105 （mol/L）-1。与用Lineweaver-Burk双倒数曲线求得BSA与CDR的结合常数相符。

3 小结

本研究利用紫外吸收光谱详细研究了BSA与CDR、CLMC、RM和KLMC相互作用。结果表明，BSA与CDR、CLMC、RM和KLMC均发生了结合作用；CDR与BSA之间存在疏水作用，而CLMC、RM、KLMC与BSA之间主要通过氢键作用结合，并由Lineweaver-Burk双倒数曲线求得CDR、CLMC、RM和KLMC与BSA的结合常数分别为：1.02×105、1.24×104、1.38×103、1.04×103 L/mol。同时以CDR为基体，研究BSA对CDR紫外光谱的影响，用Scatchard 拟合法求得结合常数为0.88×105 L/mol，两种方法结果接近。

参考文献：

[1] 田 媛，陈艳华，毕淑云，等.表面等离子体子共振传感器研究头孢菌素类药物与白蛋白的相互作用[J].分析化学，2006，34（7）：967-970.

[2] 刘家琴，田建袅，谢建平，等.厚朴酚与人血清白蛋白的相互作用研究[J].分析化学，2006，34（3）：557-560.

[3] 陈晓波，康栋国，李 崧，等.利福平与人血清白蛋白作用的荧光光谱[J].光谱学与光谱分析，2006，26（4）：674-677.

[4] 李桂芝，刘永明，虢新运，等.荧光法研究盐酸拓扑替康、盐酸依利替康喜树碱类药物和牛血清白蛋白的相互作用[J].化学学报， 2006，64（7）：679-685.

[5] 常希俊，黄 艳，贺 群.铱（Ⅳ）离子与人血丙种球蛋白的作用研究[J].化学学报，2005，63（3）：223-228.

[6] 张朝红，臧树良，耿 兵.三苯基锡化合物与牛血清白蛋白作用光谱[J].应用化学，2005，22（5）：489-493.

[7] 冯玉英，吴晓红，周家宏.竹红菌甲素与血红蛋白相互作用光谱[J].应用化学，2005，22（8）：895-898.

[8] 刘 媛，谢孟峡，康 娟.三七总皂甙对牛血清白蛋白溶液构象的影响[J].化学学报，2003，61（8）：1305-1310.

[9] 何 梅，夏之宁，阴永光，等.紫外光谱研究中药大黄有效成分与牛血清白蛋白的相互作用[J].中国现代应用药学杂志，2004，21（6）： 429-432.

（责任编辑 程碧军）endprint

比较4种抗生素的结构（图1）可知，CDR结构中含有羧基，容易解离，当CDR的浓度逐渐升高时，离子诱导BSA分子发生类似于降低pH所出现的蛋白质肽链伸展现象[5]，使包围在BSA分子内部的色氨酸和酪氨酸残基的芳杂环疏水基团裸露出来，从而使278.0 nm吸收峰的吸收增强，同时使疏水基团之间的疏水作用增强、吸收峰红移；而RM、CLMC、KLMC分子中的多个羟基与BSA肽链中的氨基酸残基中的含氧或含氮基团之间可形成氢键，从而使氨基酸残基中含氧或含氮基团原有的键强减弱而引起其吸收峰吸光度值的降低[7]。

2.2 CDR、CLMC、RM、KLMC与BSA的结合反应

紫外吸收光谱可以用来测定药物分子与蛋白质的结合常数，药物分子与蛋白质的结合可以表示为[8]：

2.3 BSA对CDR紫外吸收光谱的影响

为了进一步了解4种抗生素与BSA的相互作用信息，现以各抗生素为基体，研究BSA对其紫外光谱的影响。由于RM、CLMC与BSA本身的吸收峰有部分重叠，其相互作用的研究受到干扰；而KLMC在紫外吸收区没有吸收峰；故本研究仅考察BSA对CDR药物分子紫外吸收光谱的影响。

在所选择的试验研究条件下，CDR在紫外区的3个吸收峰分别为203.0 nm、224.0 nm和286.0 nm。试验研究表明，BSA与CDR发生相互作用在286.0 nm表现最为明显，所以选择286.0 nm处的吸收峰为主要研究对象。固定CCDR = 4.0×10-5 mol/L，随着加入BSA浓度的增加，CDR的吸收呈现明显的增色效应，最大吸收峰位蓝移，由于286.0 nm的吸收峰由CDR中C=O基的n-π*跃迁引起，因此表明BSA与CDR的C=O有明显的相互作用，但更具体的位置有待进一步研究。

根据Scatchard模型方程[9]，以ΔA对ΔA/CBSA作图，由拟合直线的斜率可以求得结合常数KA。CDR能满足Scatchard拟合，其拟合的线性程度较好（图5）。线性回归方程为y=0.156 1+11.43x，r= 0.981，求得相互作用结合常数为0.88×105 （mol/L）-1。与用Lineweaver-Burk双倒数曲线求得BSA与CDR的结合常数相符。

3 小结

本研究利用紫外吸收光谱详细研究了BSA与CDR、CLMC、RM和KLMC相互作用。结果表明，BSA与CDR、CLMC、RM和KLMC均发生了结合作用；CDR与BSA之间存在疏水作用，而CLMC、RM、KLMC与BSA之间主要通过氢键作用结合，并由Lineweaver-Burk双倒数曲线求得CDR、CLMC、RM和KLMC与BSA的结合常数分别为：1.02×105、1.24×104、1.38×103、1.04×103 L/mol。同时以CDR为基体，研究BSA对CDR紫外光谱的影响，用Scatchard 拟合法求得结合常数为0.88×105 L/mol，两种方法结果接近。

参考文献：

[1] 田 媛，陈艳华，毕淑云，等.表面等离子体子共振传感器研究头孢菌素类药物与白蛋白的相互作用[J].分析化学，2006，34（7）：967-970.

[2] 刘家琴，田建袅，谢建平，等.厚朴酚与人血清白蛋白的相互作用研究[J].分析化学，2006，34（3）：557-560.

[3] 陈晓波，康栋国，李 崧，等.利福平与人血清白蛋白作用的荧光光谱[J].光谱学与光谱分析，2006，26（4）：674-677.

[4] 李桂芝，刘永明，虢新运，等.荧光法研究盐酸拓扑替康、盐酸依利替康喜树碱类药物和牛血清白蛋白的相互作用[J].化学学报， 2006，64（7）：679-685.

[5] 常希俊，黄 艳，贺 群.铱（Ⅳ）离子与人血丙种球蛋白的作用研究[J].化学学报，2005，63（3）：223-228.

[6] 张朝红，臧树良，耿 兵.三苯基锡化合物与牛血清白蛋白作用光谱[J].应用化学，2005，22（5）：489-493.

[7] 冯玉英，吴晓红，周家宏.竹红菌甲素与血红蛋白相互作用光谱[J].应用化学，2005，22（8）：895-898.

[8] 刘 媛，谢孟峡，康 娟.三七总皂甙对牛血清白蛋白溶液构象的影响[J].化学学报，2003，61（8）：1305-1310.

[9] 何 梅，夏之宁，阴永光，等.紫外光谱研究中药大黄有效成分与牛血清白蛋白的相互作用[J].中国现代应用药学杂志，2004，21（6）： 429-432.

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