陆兵等

摘要：在盆栽条件下，以狭叶浙贝母（Fritillaria thunbergii Miq.）为材料，研究了浙贝母花期高温胁迫条件下表油菜素内酯（EBR）对浙贝母耐热性和光合特性的影响。结果表明，0.10、0.50 mg/L EBR能明显提高叶片中可溶性蛋白含量、SOD、POD和CAT活性，降低MDA含量，增强其抗氧化能力，缓解高温胁迫导致的膜质过氧化伤害；同时，EBR提高了叶片叶绿素含量、Pn、Gs和Tr，从而提高了高温胁迫下浙贝母植株的光合作用；然而EBR并不能提高其Pro及可溶性糖含量，对叶片中类胡萝卜素及胞间CO2浓度（Ci）影响差异不大。结果表明，EBR通过提高高温胁迫下浙贝母叶片可溶性蛋白及叶绿素含量、抗氧化酶活性，来降低体内活性氧水平，维持较高的光合速率，以0.50 mg/L EBR效果最好。

关键词：高温胁迫；2，4-表油菜素内酯；浙贝母（Fritillaria thunbergii Miq.）；耐热性；光合特性

中图分类号：S567.23+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）16-3845-04

Abstract：The effects of epibrassionlide on thermotolerance and photosynthesis in leaves of F. thunbergii（xiaye） grown in pots were investigated under high temperature. The results showed that the treatment of 0.10，0.50 mg/L-1 2.4-epibrassionlide could effectively enhance antioxidation ability and alleviate injury of membrane lipid peroxidation caused by high temperature through increasing content of soluble protein， activities of superoxide dismutase（SOD），peroxidase （POD） and catalase（CAT），and decreasing malondialdehyde（MDA） content. EBR pretreatment improved the photosynthesis in F. thunbergii（xiaye）leaves by increasing the chlorophyll content， net photosynthetic rate（Pn），stomatal conductance（Gs），ranspiration rate（Tr）. EBR pretreatment couldnt increase contents of proline and soluble sugar， and had little effect on carotenoid content and intercellular CO2 concentration（Ci） in leaves. It is indicated that EBR pretreatment could suppress reactive oxygen levels， keep higher photosynthetic rate by increasing contents of soluble protein and chlorophyll， activities of antioxidant enzymes. The better alleviating effect on high temperature damage was 0.50 mg/L EBR.

Key words：high temperature stress；2，4-Epibrassinolide； Fritillaria thunbergii Miq.；thermotolerance； photosynthesis

浙贝母（Fritillaria thunbergii Miq.）是中国五大类贝母中最主要的贵重药材，被列为“浙八味”之首，历版《中国药典》均有收载。浙贝母喜温凉的气候条件，平均气温在17 ℃左右时，地上部茎叶生长迅速，气温高到30 ℃时，浙贝母生长受到抑制，造成植株枯萎倒苗。在浙贝母大田生产中，初夏高温（30 ℃）将严重影响浙贝母的生长期长短[1]。因此，提高浙贝母的耐热性是生产中一个急需解决的问题。

油菜素内酯（Brassinolide，BR）是植物正常生长和发育所必需的，在植物体内含量极低，但生理活性极高，目前已被公认为一类新型的植物生长调节物质，被称为第六大类植物激素。人工合成的高活性油菜素内酯类似物为表油菜素内酯（EBR）。研究表明，BR不仅能影响植物的生长发育，例如能增强细胞的分裂和伸长、提高光合速率、促进光合作用、促进生长等，而且也参与植物的逆境反应[2]。张永平等[3]用1.0 mg/L的EBR溶液处理甜瓜幼苗，能明显促进高温胁迫下甜瓜幼苗的生长，提高保护酶活性，增强植株抗氧化能力，促进脯氨酸和可溶性蛋白含量升高，丙二醛（MDA）含量下降，能有效缓解高温胁迫引起的膜脂过氧化伤害；同时能减轻高温胁迫对光合作用的抑制作用。本试验以浙贝母为材料，研究叶面喷施不同浓度的EBR对高温胁迫下浙贝母抗热性相关生理指标及光合作用的影响，旨在为EBR在提高浙贝母耐热性方面的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

试验于2012年9月至次年3月在南通农业职业技术学院温室大棚内进行。浙贝母采自于浙江省鄞州区。选择完好的鳞茎进行盆栽，盆高20 cm，直径20 cm，基质为均匀一致的轻黏壤土，每盆播种4个鳞茎，播种深度5～6 cm，置于温室大棚内，管理措施一致。从次年3月11日起于每天8：00分别喷施0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 mg/L的表油菜素内酯，以喷施清水为对照，叶片正反面均进行喷施，至布满液珠而不滴为度。连续喷施4 d后，将浙贝母苗移至光照培养箱（宁波江南仪器制造厂生产）内，温度为30 ℃/25 ℃（昼/夜）、光照度3 600 lx、光周期12 h/12 h （昼/夜），进行高温胁迫处理。处理3 d后，将浙贝母转移至自然光照条件下取样进行相关指标测定。为了避免水分胁迫，高温处理期间保持土壤湿润，培养箱内相对湿度保持在70%～80%。

1.2 测定项目与方法

叶绿素（Chl）含量采用浸提法[4]；采用LI-6400便携式光合仪对叶片的净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）及蒸腾速率（Tr）进行测定。

可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法测定；脯氨酸（Pro）含量测定采用酸性茚三酮比色法；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用NBT光还原法测定；过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法测定；过氧化氢酶（CAT）活性采用高锰酸钾滴定法测定；丙二醛（MDA）含量用硫代巴比妥酸法[5]测定。

2 结果与分析

2.1 EBR对高温胁迫下浙贝母光合特性的影响

2.1.1 EBR对高温胁迫下浙贝母光和色素含量的影响 由表1可知，EBR处理后，浙贝母在高温胁迫后叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总量均有明显增加，在0.01～0.50 mg/L EBR范围内，三者与EBR浓度呈正相关。1.00 mg/L EBR下，叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总量虽较对照增加了17.02%、24.73%和18.91%，差异显著，但与0.50 mg/L相比，三者含量均有所下降。而各浓度EBR浙贝母在高温胁迫后，其类胡萝卜素含量与对照均无显著差异。

2.1.2 EBR对高温胁迫下浙贝母光和指标的影响 由表2可知，EBR能显著提高高温胁迫后浙贝母叶片的Pn，随着EBR浓度的增加Pn先升高后降低，在0.50 mg/L时，Pn达到最高，较对照增加了175.83%。EBR在增加Pn的同时，也提高了浙贝母叶片的Gs和Tr，在0.50 mg/L时，两者同样达到最高，较对照分别增加了179.41%和220.49%。在各浓度EBR下，浙贝母叶片Ci与对照相比均无显著差异。

2.2 EBR对高温胁迫下浙贝母叶片渗透调节物质含量的影响

由表3可知，EBR对高温胁迫后浙贝母叶片脯氨酸的含量有明显影响。除EBR浓度为0.01 mg/L时，脯氨酸含量较对照高外，其他处理均低于对照，且随着EBR浓度的升高，脯氨酸含量表现出先降后升的趋势。在EBR浓度为0.10和0.50 mg/L时，叶片脯氨酸含量显著低于对照，其他3个浓度处理较对照低，但并无显著差异。

经EBR处理，高温胁迫后浙贝母叶片可溶性蛋白的含量与脯氨酸相比表现出相反的趋势，即可溶性蛋白含量随着EBR浓度的升高先上升后下降，且均高于对照。0.50 mg/L EBR处理的浙贝母叶片可溶性蛋白含量最高，比对照高出41.55%，之后下降。

在高温胁迫后，经EBR处理的浙贝母叶片可溶性糖含量均低于对照，0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 mg/L EBR处理分别比对照下降了29.59%、9.59%、22.99%、1.52%和14.77%，其中0.05、0.50 mg/L EBR处理与对照无显著差异，其他处理则显著低于对照。

2.3 EBR对高温胁迫下浙贝母抗氧化代谢的影响

由表4可知，EBR处理对浙贝母叶片SOD、POD及CAT的活性和MDA的含量具有显著影响，随着EBR浓度的升高，3种酶活性均呈先升高后下降的趋势，而MDA含量表现出相反的趋势，表明EBR对浙贝母幼苗上述3种酶活性及MDA含量的影响具有剂量效应。

与对照相比，EBR在0.01～1.00 mg/L的浓度范围内，均能提高浙贝母叶片SOD活性，其中EBR浓度为0.01 mg/L时SOD活性差异不显著，其余处理差异显著，且在0.50 mg/L时达到最大值，较对照上升了164.25%，随之EBR处理对SOD活性的提高作用减弱。

与对照相比，0.01～0.50 mg/L的EBR处理均能提高浙贝母叶片POD活性，其中以0.50 mg/L处理活性最高，且差异显著；当EBR处理浓度为1.00 mg/L时，POD活性反而较对照下降了5.48%。

不同浓度EBR显著提高了浙贝母叶片CAT活性，在EBR浓度为0.50 mg/L时达到最大值，各处理下CAT活性较对照分别升高了40.88%、74.91%、101.05%、144.44%和24.66%，差异显著。

经过EBR处理的浙贝母在高温胁迫3 d后叶片MDA含量较对照均有不同程度的下降，且具有显著差异，随EBR浓度的增加，其含量表现出先降低后升高的趋势。0.50 mg/L EBR处理下的MDA含量达到最低，与对照相比下降了36.33%，EBR浓度为1.00 mg/L时，MDA含量上升，但仍较对照低。

3 讨论

正常环境下生长的植物体内，活性氧产生与淬灭处于动态平衡，而高温胁迫严重影响植物生物膜系统的稳定性，导致活性氧代谢失衡，细胞内活性氧大量积累而使细胞受到了氧胁迫，同时，高温胁迫下光合作用普遍受到抑制[6]。浙贝母生长期较短，高温胁迫是其主要限制因素之一。

许多研究证明，BR能通过提高细胞保护酶活性和光合作用、促进脯氨酸累积及改善细胞膜透性等方面来提高植物的抗逆性（抗旱性、抗冷抗寒性、抗热性、抗盐性、抗药性、抗毒性）[7]。

3.1 EBR对高温胁迫下浙贝母光合特性的影响

光合作用是植物对于高温胁迫最为敏感的生理反应之一，往往在其他的高温诱导伤害症状出现之前就已因高温受到抑制[8]。高温抑制植物的光合作用，导致光合速率下降可能是气孔因素，也可能是非气孔因素引起的。Farquhar等[9]认为，如果Gs下降，而Ci维持不变甚至上升，则光合速率的下降应是由叶肉细胞同化能力降低等非气孔因素所致；只有Ci和Gs同时下降，才能表明光合速率的下降主要是由气孔因素引起的。区分影响光合作用的气孔和非气孔因素有利于理解EBR促进光合作用的作用位点。

本研究结果表明，高温胁迫后，各EBR处理下的浙贝母叶片Gs均较对照高，但Ci并无显著差异，因此，EBR并不是通过降低气孔限制来提高Pn，这与张永平等[10]用EBR处理提高高温胁迫后甜瓜叶片净光合速率的结果一致。而Tr的升高说明EBR能通过提高浙贝母高温胁迫下的蒸腾速率来调节体温和矿质盐的运转，从而减轻高温伤害。叶绿素含量是影响光合作用光能吸收的重要因子，0.05～1.0 mg/L EBR均能显著提高浙贝母叶绿素含量，这与阮英慧[11]的研究结果类似。据此推测，EBR可能通过促进光合机构对CO2的利用能力及提高高温胁迫后浙贝母叶片的叶绿素含量来提高光合作用。

3.2 EBR对高温胁迫下浙贝母叶片渗透调节物质含量的影响

渗透调节是抵抗逆境胁迫的一种重要方式，游离Pro、可溶性糖和可溶性蛋白是植物体内3种主要的有机渗透调节物质，在高温环境下，植物主动积累渗透调节物质，抵抗热胁迫的伤害[12]。植物体中高的Pro含量具有较强的渗透调节能力及保护细胞膜结构稳定的作用，与细胞内的一些化合物形成类似亲水胶体的聚合物，有一定的保水作用[13]。可溶性蛋白含量的提高可以增加细胞的渗透势和功能蛋白（如热激蛋白）的数量，有助于维持细胞正常的代谢，提高植物的抗逆性[14]。逆境胁迫下，植物细胞中积累的可溶性糖参与渗透保护、渗透调节、碳的储藏以及活性氧的清除[15]。研究表明，用EBR分别处理高温胁迫下的黄瓜（48 ℃）和甜瓜（42 ℃）幼苗，能显著增加幼苗体内的可溶性蛋白和脯氨酸含量[10，16]。

本研究结果表明，高温胁迫后，经0.50 mg/L EBR处理的浙贝母叶片的可溶性蛋白含量显著高于对照，但各浓度EBR并不能显著提高其脯氨酸和可溶性糖的含量，与对照相比，其含量甚至较低，这与王炳奎[17]关于表油菜素内酯对水稻幼苗抗冷性的影响研究中脯氨酸的变化类似。因此，本研究认为EBR并不能通过增加浙贝母叶片渗透性物质的积累来提高其渗透调节能力，进而提高其耐热性。另外研究表明，植物耐热性的产生与热激蛋白的合成有关[18]。本研究中浙贝母可溶性蛋白含量增加的原因可能是由于高温胁迫下EBR能促进浙贝母合成更多的热激蛋白，使植物耐热性增强，但也不排除EBR降低了蛋白质降解速率及难溶性蛋白变成可溶的可能。

3.3 EBR对高温胁迫下浙贝母抗氧化代谢的影响

高温胁迫会使植株活性氧生成增加，膜质过氧化，产生MDA，损伤生物膜系统，使细胞受到氧化胁迫。抗氧化酶活性与植物活性氧代谢直接相关，其活性水平间接地反映了植物抗高温胁迫的能力[6]。SOD、CAT、POD是植物体内酶促防御系统的3个重要保护酶，SOD能催化植株体内的歧化反应，使■转化为H2O2和O2，H2O2再通过CAT和POD分解成没有毒害的H2O和O2，它们对植物体内活性氧的清除起重要作用[19]。万正林等[20]报道0.50 mg/L EBR诱导番茄幼苗耐热性的作用机理在于喷施处理EBR后，在高温胁迫条件下能够维持番茄幼苗较高的抗氧化酶活性，减少膜质过氧化的产生，从而保护细胞膜的热稳定性，提高其抗高温能力。

本试验结果表明，在0.5 mg/L EBR下，高温胁迫后浙贝母叶片SOD、POD和CAT活性较对照显著增加，MDA含量显著减少，这说明EBR可以明显提高浙贝母的耐热性。

参考文献：

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[20] 万正林，罗庆熙，李立志.表油菜素内酯诱导番茄幼苗抗高温机理的研究[J].广西农业科学，2009，40（9）：1203-1208.

3.2 EBR对高温胁迫下浙贝母叶片渗透调节物质含量的影响

渗透调节是抵抗逆境胁迫的一种重要方式，游离Pro、可溶性糖和可溶性蛋白是植物体内3种主要的有机渗透调节物质，在高温环境下，植物主动积累渗透调节物质，抵抗热胁迫的伤害[12]。植物体中高的Pro含量具有较强的渗透调节能力及保护细胞膜结构稳定的作用，与细胞内的一些化合物形成类似亲水胶体的聚合物，有一定的保水作用[13]。可溶性蛋白含量的提高可以增加细胞的渗透势和功能蛋白（如热激蛋白）的数量，有助于维持细胞正常的代谢，提高植物的抗逆性[14]。逆境胁迫下，植物细胞中积累的可溶性糖参与渗透保护、渗透调节、碳的储藏以及活性氧的清除[15]。研究表明，用EBR分别处理高温胁迫下的黄瓜（48 ℃）和甜瓜（42 ℃）幼苗，能显著增加幼苗体内的可溶性蛋白和脯氨酸含量[10，16]。

本研究结果表明，高温胁迫后，经0.50 mg/L EBR处理的浙贝母叶片的可溶性蛋白含量显著高于对照，但各浓度EBR并不能显著提高其脯氨酸和可溶性糖的含量，与对照相比，其含量甚至较低，这与王炳奎[17]关于表油菜素内酯对水稻幼苗抗冷性的影响研究中脯氨酸的变化类似。因此，本研究认为EBR并不能通过增加浙贝母叶片渗透性物质的积累来提高其渗透调节能力，进而提高其耐热性。另外研究表明，植物耐热性的产生与热激蛋白的合成有关[18]。本研究中浙贝母可溶性蛋白含量增加的原因可能是由于高温胁迫下EBR能促进浙贝母合成更多的热激蛋白，使植物耐热性增强，但也不排除EBR降低了蛋白质降解速率及难溶性蛋白变成可溶的可能。

3.3 EBR对高温胁迫下浙贝母抗氧化代谢的影响

高温胁迫会使植株活性氧生成增加，膜质过氧化，产生MDA，损伤生物膜系统，使细胞受到氧化胁迫。抗氧化酶活性与植物活性氧代谢直接相关，其活性水平间接地反映了植物抗高温胁迫的能力[6]。SOD、CAT、POD是植物体内酶促防御系统的3个重要保护酶，SOD能催化植株体内的歧化反应，使■转化为H2O2和O2，H2O2再通过CAT和POD分解成没有毒害的H2O和O2，它们对植物体内活性氧的清除起重要作用[19]。万正林等[20]报道0.50 mg/L EBR诱导番茄幼苗耐热性的作用机理在于喷施处理EBR后，在高温胁迫条件下能够维持番茄幼苗较高的抗氧化酶活性，减少膜质过氧化的产生，从而保护细胞膜的热稳定性，提高其抗高温能力。

本试验结果表明，在0.5 mg/L EBR下，高温胁迫后浙贝母叶片SOD、POD和CAT活性较对照显著增加，MDA含量显著减少，这说明EBR可以明显提高浙贝母的耐热性。

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3.2 EBR对高温胁迫下浙贝母叶片渗透调节物质含量的影响

渗透调节是抵抗逆境胁迫的一种重要方式，游离Pro、可溶性糖和可溶性蛋白是植物体内3种主要的有机渗透调节物质，在高温环境下，植物主动积累渗透调节物质，抵抗热胁迫的伤害[12]。植物体中高的Pro含量具有较强的渗透调节能力及保护细胞膜结构稳定的作用，与细胞内的一些化合物形成类似亲水胶体的聚合物，有一定的保水作用[13]。可溶性蛋白含量的提高可以增加细胞的渗透势和功能蛋白（如热激蛋白）的数量，有助于维持细胞正常的代谢，提高植物的抗逆性[14]。逆境胁迫下，植物细胞中积累的可溶性糖参与渗透保护、渗透调节、碳的储藏以及活性氧的清除[15]。研究表明，用EBR分别处理高温胁迫下的黄瓜（48 ℃）和甜瓜（42 ℃）幼苗，能显著增加幼苗体内的可溶性蛋白和脯氨酸含量[10，16]。

本研究结果表明，高温胁迫后，经0.50 mg/L EBR处理的浙贝母叶片的可溶性蛋白含量显著高于对照，但各浓度EBR并不能显著提高其脯氨酸和可溶性糖的含量，与对照相比，其含量甚至较低，这与王炳奎[17]关于表油菜素内酯对水稻幼苗抗冷性的影响研究中脯氨酸的变化类似。因此，本研究认为EBR并不能通过增加浙贝母叶片渗透性物质的积累来提高其渗透调节能力，进而提高其耐热性。另外研究表明，植物耐热性的产生与热激蛋白的合成有关[18]。本研究中浙贝母可溶性蛋白含量增加的原因可能是由于高温胁迫下EBR能促进浙贝母合成更多的热激蛋白，使植物耐热性增强，但也不排除EBR降低了蛋白质降解速率及难溶性蛋白变成可溶的可能。

3.3 EBR对高温胁迫下浙贝母抗氧化代谢的影响

高温胁迫会使植株活性氧生成增加，膜质过氧化，产生MDA，损伤生物膜系统，使细胞受到氧化胁迫。抗氧化酶活性与植物活性氧代谢直接相关，其活性水平间接地反映了植物抗高温胁迫的能力[6]。SOD、CAT、POD是植物体内酶促防御系统的3个重要保护酶，SOD能催化植株体内的歧化反应，使■转化为H2O2和O2，H2O2再通过CAT和POD分解成没有毒害的H2O和O2，它们对植物体内活性氧的清除起重要作用[19]。万正林等[20]报道0.50 mg/L EBR诱导番茄幼苗耐热性的作用机理在于喷施处理EBR后，在高温胁迫条件下能够维持番茄幼苗较高的抗氧化酶活性，减少膜质过氧化的产生，从而保护细胞膜的热稳定性，提高其抗高温能力。

本试验结果表明，在0.5 mg/L EBR下，高温胁迫后浙贝母叶片SOD、POD和CAT活性较对照显著增加，MDA含量显著减少，这说明EBR可以明显提高浙贝母的耐热性。

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