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SD新生大鼠c-kit阳性心肌细胞的分离纯化

2014-10-16李润琴

中国民族民间医药 2014年18期
关键词:磁珠孵育心肌细胞

李润琴 黄 春

重庆三峡医药高等专科学校,重庆 404020

全世界每年失代偿心衰治疗花费高达1200亿美元,5年死亡率50%左右。心肌梗死是全球致死和致残的主要疾病之一。以2011年为例,中国有50~60万急性心肌梗死患者。β-阻滞剂、ACEI和醛固酮受体拮抗剂等药物旨在减少心肌缺血损伤;心脏同步化治疗以及辅助装置等旨在减少心衰死亡率,改善患者生活质量;对于心衰患者,心脏的再生治疗才能保留正常心肌功能。迄今心脏移植才是唯一有效治疗手段。然而,全球心脏移植供体短缺是巨大障碍。随着新的治疗手段的探索,10年前多能干细胞已经应用于心脏再生治疗。近期,科学家们发现了人的心脏中有可分化为所有主要心脏细胞的干细胞,心肌损伤的患者在损伤的心肌处注射体外培养的心肌干细胞,可以治疗缺血性心肌病。该发现为自体细胞用于受损心脏的治疗开辟了一条新的道路。目前干细胞移植正处于技术瓶颈阶段,干细胞移植的效果在多数研究中基本上得到了肯定,但是还存在许多急待解决的问题,如干细胞治疗各种疾病的确切机制、移植后的远期效果等尚不清楚。本课题做为此研究方向的基础性工作,致力于建立一种简单有效的、重复性好的,对具有心肌干细胞蛋白表达特性的心肌细胞的分离培养的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 性成熟SD大鼠 (1只雄鼠、1只雌鼠)购自重庆医科大学实验动物中心。饲养2周,产7只新生大鼠,取24小时之内新生大鼠实验。

1.1.2 试剂 cTnT、GATA4抗体购自santa cruz公司。低糖DMEM、胎牛血清、Trypsin-EDTA和PBS培养基购自Gibco公司。c-kit免疫磁珠购自Miltenyi公司。

1.2 方法

1.2.1 心肌细胞培养 将新生大鼠用75%酒精消毒后,打开胸腔,剪取心尖部,用PBS反复冲洗,将其剪碎成1mm3以下的组织块,铺平在细胞培养瓶中,置于37℃,5%CO2恒温培养箱中培养。组织块贴壁约2~3h后,补加含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养,48h后观察记录。

1.2.2 免疫磁珠分选c-kit阳性心肌细胞 取培养48h的原代心肌细胞用0.5%Trypsin-EDTA消化,上分离柱前,充分振荡,混悬细胞,打散细胞团块。用分离柱分选,真空抽滤水,减少水中气泡,使分离柱不被气泡阻滞。将ckit抗体接上磁珠,再将心肌细胞悬液加入分离柱 (有c-kit抗体的磁珠将会抓住c-kit阳性的细胞,c-kit阴性的细胞则被分离),移除磁场,收集c-kit阳性细胞。

1.2.3 c-kit阳性心肌细胞传代 免疫磁珠分选c-kit阳性心肌细胞后,继续体外培养生长5d,细胞增殖可进行传代 (弃去培养瓶中培养液,PBS洗2~3次,加入0.5%Trypsin-EDTA消化2min,镜下见细胞收缩变圆,立即加入等体积培养液终止消化。反复用吸管吸取瓶底液体吹打培养瓶壁,使附壁细胞脱落形成细胞悬液。将悬液移至离心管,于1000r/min转速下离心3min,弃去上清,继续培养)。

1.2.4 免疫细胞化学法检测心肌细胞 取细胞爬片,进行cTnT免疫细胞化学反应。用37℃ PBS(PH=7.2)反复冲洗3次。每次3分钟。–20℃丙酮固定10min,自然干燥。每张加50μl过氧化物酶阻断剂,室温下孵育10min,以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS液反复冲洗3次,每次2min。除去 PBS液,加50μl10%山羊血清,室温下孵育10min。除去血清,分别加100μl一抗 Desmin(1∶50),cT-nT(1∶400)完全覆盖待检组织,室温下孵育2小时。PBS液反复冲洗,除去PBS液,分别加入100μl辣根过氧化物酶标记链亲和素。室温下孵育10min。加入100μl DAB显色液。自来水反复冲洗,苏木素复染,自来水再次冲洗反蓝。经梯度酒精脱水 (70%、80%、90%酒精:2min×1次,95%酒精:2min×2次,100%酒精:2min×3次),二甲苯(二甲苯Ⅰ:2min×1次,二甲苯Ⅱ:2min×1次)透明,干燥,中性树胶封片。阴性对照以PBS代替一抗作为阴性对照。

2 结果

2.1 心肌细胞形态 原代心肌组织植入培养瓶后,2d可见有细胞自心肌组织边缘爬出,并可见成簇的心肌细胞搏动(图1)。免疫磁珠分选c-kit阳性的心肌细胞,传代培养可见细胞继续分裂 (图2)。

2.2 心肌细胞胞质Desmin和cTnT表达 免疫磁珠分选ckit阳性心肌细胞传代培养后,胞浆呈现棕黄色,Desmin和cTnT呈阳性表达,Desmin和cTnT有较高的心肌细胞特异性 (图3)。

3 讨论

2011年11 月14 日英国《柳叶刀》在线发布的研究报告说,美国研究人员用心脏干细胞治疗心肌梗塞的临床试验获得成效。美国路易斯维尔大学等机构的研究人员报告说,有16名心肌梗塞患者接受了干细胞疗法,研究人员在试管中对获得的干细胞进行了培养,在约4个月后将培养所得的大量干细胞注射回其主人的心脏中,期待它们成长为新的健康心脏组织。结果显示,这些患者由于心肌受损,左心室在一次心跳中将血液正常压出心室的几率原本已降到30.3%,但在接受干细胞治疗后,这一比例已升至38.5%。如果后续研究能进一步支持这种心脏干细胞疗法的有效性,可能会成为心血管医疗领域的重大进步[1-2]。

多个研究小组都表明,心肌的多数成分均可由心外来源的祖细胞分化而来,但不同细胞类型其再生率差别极大。而不幸的是,心肌细胞再生率最低。采用组织培养法获取细胞,可避免细胞因长时间消化造成的损伤,减少了杂细胞的干扰,并且可以在同一组织块中周期性的获得细胞,提高了心肌标本的利用率。

c-kit是经典的干细胞表面标志之一,c-kit+细胞在人体中存在是较为肯定的。当然,目前鉴别心肌干细胞的方法尚缺乏统一标准,心脏特异性标记蛋白还有 GATA4,MEF2C,Nkx2.5/Csx等等[3]。Dawn等研究表明在增殖潜能和心肌修复方面,c-kit+心肌干细胞要明显强于Sca-1+的心肌干细胞[4]。尽管有人持有不同观点[5],但在确定有助于修复受损心脏的多能干细胞中,鉴别出真正的祖细胞是非常必要的。因此本实验选取c-kit作为纯化和鉴定具有心肌干细胞特性的表面标记。本实验用免疫磁珠分离新生SD大鼠心肌细胞中的c-kit+细胞,在倒置显微镜下观察到c-kit+细胞分裂,并继续培养传代。结果证明用免疫磁珠可以分选具有心肌干细胞特征表型的心肌细胞。用免疫细胞化学法证明了心肌细胞的特异性标记物Desmin和cTnT的阳性表达。本次实验仅仅鉴别了c-kit+心肌细胞,尚属基础性工作,课题组将沿着此方向继续培养并鉴定增殖分化成熟的心肌干细胞。

[1]Bolli R,Chugh AR,D’Amario D,et al.Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy(SCIPIO):initial results of a randomised phase 1 trial[J].Lancet,2011,378(9806):1847-1857.

[2]Chugh AR,Beache GM,Loughran JH,et al.Administration of cardiac stem cells in patients with ischemic cardiomyopathy:the SCIPIO trial:surgical aspects and interim analysis of myocardial function and viability by magnetic resonance[J].Circulation.,2012,126(1):54-64.

[3]Antonio P.Beltrami,Laura Barlucchi,Daniele Torella,et al.Adult Cardiac Stem Cells Are Multipotent and Support Myocardial Regeneration [J].Cell,2003,114(6):763-776.

[4]Dawn B,Stein AB,Urbanek K,et al.Cardiac stem cells deliv-ered intravascularly traverse the vessel barrier,regenerate in-farcted myocardium,and improve cardiac function [J].ProcNatl Acad Sci USA,2005,102:3766-3771.

[5]Cheng K,Blusztajn A,Shen D,et al.Functional performance of human cardiosphere-derived cells delivered in an in situ polymerizable hyaluronan-gelatin hydrogel[J].Biomaterials,2012,33(21):5317-5324.

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