刘秋霞 冯军 赵志国 刘冰慧 龚志平

白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是由T辅助细胞产生的细胞因子，具有广泛的生物学活性，在免疫应答的调节过程中起着重要作用。本实验的目的就是克隆IL-2基因为下一步IL-2cDNA导入其他细胞为其临床应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 C57BL/6小鼠、大肠杆菌DH5α、质粒 PEGFP-N1载体、SuperscriptTMIII/RNaseOutTM Enzyme Mix(Invitrogen公司)、Pfu DNA聚合酶(北京天为时代科技有限公司)、T4 DNA 连接酶、BamH I、KpnI、BglII(Takara公司)、RNA提取试剂盒、RT试剂盒、PCR试剂盒(Invitrogen公司)、DNA凝胶回收试剂盒、质粒DNA提取与纯化试剂盒(Promega公司)、标准分子量DNA、PCR Markers(北京天为时代科技有限公司)

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取:颈脱位处死C57BL/6小鼠，无菌摘除脾脏，使用RNA提取试剂盒提取RNA并进行完整性及纯度测定。

1.2.2 RT-PCR:按照Genebank提供的序列，由上海生工生物工程有限公司设计合成引物。分别为:β-actin:上游5’＞CCCCAAGGCCAACCGTGAA ＜3’下游5’＞CGGAATCGCTCGTTGCCAATGT＜3’扩增产物为 435 bp。IL-2:1:5’-CCTTGCTAATCACTCCTCAC 2:5’-TATGTGTTGTAAGCAGGAGG扩增产物为510 bp。参照RT试剂盒、PCR试剂盒(Invitrogen公司)试剂盒说明，得到PCR产物，经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，如见到预期510 bp大小的 DNA条带，则表明 IL-2cDNA扩增成功。

1.2.3 PCR产物回收与纯化:取PCR后产物按照DNA凝胶回收试剂盒(Promega公司)进行回收与纯化。

1.2.4 真核表达载体PEGFP-N1-IL-2的构建:分别取用限制性内切酶BamHI和KpnI双酶切后的PCR产物和用限制性内切酶BamHI、限制性内切酶KpnI双酶切后质粒PEGFP-N1大片段，加入T4DNA连接酶作定向连接，将连接体转化至感受态细胞并转移到含有卡那霉素的LB固体培养基上，涂布均匀，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，于37℃培养16 h待菌落长出。挑取一个长出的菌落加入含有卡那霉素的LB液体培养基的试管中，放入37℃摇床中250 r/min摇菌过夜培养12 h后用质粒提取试剂盒按照其操作说明提取质粒。……