刘秋霞 冯军 赵志国 刘冰慧 龚志平

白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是由T辅助细胞产生的细胞因子，具有广泛的生物学活性，在免疫应答的调节过程中起着重要作用。本实验的目的就是克隆IL-2基因为下一步IL-2cDNA导入其他细胞为其临床应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 C57BL/6小鼠、大肠杆菌DH5α、质粒 PEGFP-N1载体、SuperscriptTMIII/RNaseOutTM Enzyme Mix(Invitrogen公司)、Pfu DNA聚合酶(北京天为时代科技有限公司)、T4 DNA 连接酶、BamH I、KpnI、BglII(Takara公司)、RNA提取试剂盒、RT试剂盒、PCR试剂盒(Invitrogen公司)、DNA凝胶回收试剂盒、质粒DNA提取与纯化试剂盒(Promega公司)、标准分子量DNA、PCR Markers(北京天为时代科技有限公司)

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取:颈脱位处死C57BL/6小鼠，无菌摘除脾脏，使用RNA提取试剂盒提取RNA并进行完整性及纯度测定。

1.2.2 RT-PCR:按照Genebank提供的序列，由上海生工生物工程有限公司设计合成引物。分别为:β-actin:上游5’＞CCCCAAGGCCAACCGTGAA ＜3’下游5’＞CGGAATCGCTCGTTGCCAATGT＜3’扩增产物为 435 bp。IL-2:1:5’-CCTTGCTAATCACTCCTCAC 2:5’-TATGTGTTGTAAGCAGGAGG扩增产物为510 bp。参照RT试剂盒、PCR试剂盒(Invitrogen公司)试剂盒说明，得到PCR产物，经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，如见到预期510 bp大小的 DNA条带，则表明 IL-2cDNA扩增成功。

1.2.3 PCR产物回收与纯化:取PCR后产物按照DNA凝胶回收试剂盒(Promega公司)进行回收与纯化。

1.2.4 真核表达载体PEGFP-N1-IL-2的构建:分别取用限制性内切酶BamHI和KpnI双酶切后的PCR产物和用限制性内切酶BamHI、限制性内切酶KpnI双酶切后质粒PEGFP-N1大片段，加入T4DNA连接酶作定向连接，将连接体转化至感受态细胞并转移到含有卡那霉素的LB固体培养基上，涂布均匀，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，于37℃培养16 h待菌落长出。挑取一个长出的菌落加入含有卡那霉素的LB液体培养基的试管中，放入37℃摇床中250 r/min摇菌过夜培养12 h后用质粒提取试剂盒按照其操作说明提取质粒。取部分提取的质粒为模板，以PCR引物Primer1、Primer2进行PCR扩增，其PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳观察电泳带，鉴定融合质粒PEGFP-N1-IL-2构建是否成功。

1.2.5 序列分析:取上述经PCR鉴定的菌液送测序公司进行基因序列测定。

2 结果

2.1 C57BL/6小鼠脾组织总RNA的提取 以C57BL/6小鼠脾组织为原材料提取总RNA，紫外分光光度计测定表明OD260/OD280=1.845，1%的琼脂糖凝胶电泳结果显示28S.18S.5S三条明显条带，且28S＞18S，说明提取的总RNA完整且纯度符合反转录要求。见图1。

2.2 RT-PCR 用所提取的总RNA和Primer1.Primer2.进行RT-PCR，同时以β-actin作为内参照，其产物经1%的琼脂糖凝胶电泳结果显示一条510 bp预期长度的条带，与目的基因长度一致。说明IL-2 mRNA提取成功，逆转录合成的cDNA完整，初步证明目的基因克隆成功。见图2。

2.3 扩增片段的基因克隆 将RT-PCR纯化产物与质粒PEGFP-N1分别用限制性内切酶BamH I和Kpn I双酶切后，加入T4DNA连接酶作定向连接，构建重组质粒PEGFP-N1-IL-2。经1%的琼脂糖凝胶电泳显示重组质粒PEGFP-N1-IL-2构建成功。见图3。

图1 总RNA

图2 RT-RCR显示510 bp预期长度条带

图3 扩增片段的基因克隆

2.4 克隆片段的DNA序列分析 将重组质粒PEGFP-N1-IL-2送测序公司进行测序，结果与Genebank中小鼠IL-2cDNA(K02292)序列完全一致。见图4。

图4 IL-2cDNA序列

3 讨论

细胞因子是由机体活化的免疫细胞及某些基质细胞分泌的小分子蛋白质，通过结合细胞表面的相应受体发挥生物学效应。其主要的生物学功能是介导和调节免疫应答和炎性反应。IL-2是其中一种，1976年Morgan等发现小鼠脾细胞培养上清中含有一种刺激胸腺细胞生长的因子，由于这种因子能促进和维持T细胞长期培养，称为T细胞生长因子(T cell growth factor，TCGF)，1979 年统一命名为 IL-2。IL-2 分子量为15.5 ku的蛋白质分子，由133个氨基酸残基组成，有多重生物学功能，主要是促进T细胞生长、增殖及分化［1］;调节NK 细胞并保持它的自然杀伤力［2］;诱导细胞毒性T细胞的增殖和产生;促进B淋巴细胞的增殖作用;与其他细胞因子的协同作用［3］;可激活产生淋巴因子的杀伤(LAK)细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，刺激B细胞增殖分化和分泌抗体，并可诱导T细胞分泌 IFN-γ、TNF、CSF 等细胞因子等［4］，多重免疫学功能使其在多领域被广泛研究并在临床应用方面发挥着重要的作用，尤其对肾细胞癌、黑色素瘤、白血病、肺癌、癌性胸腹水等的治疗、抗感染、自身免疫性疾病等方面都有一定的应用。IL-2的血浆半衰期仅约为2 h，临床上为维持其疗效常须大剂量频繁注射，这不仅导致其毒性增加，还提高了治疗成本。它的毒副作用主要会出现感冒样症状如寒战、头痛，胃肠道反应恶心、呕吐、等，毛细血管渗漏综合征(CLS)如少尿、水肿、低血压等，神经系统症状如焦虑、幻觉、昏迷等，感染，贫血等。为了克服IL-2半衰期短和病灶局部量不足的这些缺点，比如利用转基因表达IL-2治疗恶性肿瘤的基础研究中，将携带IL-2基因的真核表达载体直接导入病灶，有可能发展成为肿瘤治疗的有效方法［5］。所以我们构建了真核表达载体PEGFP-N1-IL-2，为其下一步转染到真核或原核细胞持续分泌IL-2更有效的应用于临床作准备。目前，对于IL-2的研究日益加深，对于其在临床治疗上起到了不可忽视的作用，但在某些方面还存在一些分歧，有待进一步研究。

1 Lan RY，Selmi C，Gershwin ME.The regulatory，inflammatory，and T cell programming roles of interleukin-2(IL-2).Autoimmun，2008，31:7-12.

2 Gruenbacher G，Gander H，Nussbaumer O，et al.IL-2 costimulation enables statin mediated activation of human NK cells，preferentially through a mechanism involving CD56+dendritic cells.Cancer Res，2010，70:9611-9620.

3 Yang H，Cheng EY，Sharma VK，et al.Dendritic cells with TGF-1 and IL-2 differentiate naive CD4+T cells into alloantigen specific and allograft protective Foxp3+regulatory T cells.Transplantation，2012，93:580-588.

4 Vella AT，Dow S，Potter TA，et al.Cytokine-induced survival of activated T cells in vitro and in vivo.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95:3810-3815.

5 金晓凌，井清源，王炳生，等.瘤体内直接注射白介素-2质粒复合物治疗小鼠肝癌.中国肿瘤临床，2001，28:779-782.