刘玉琴，谢 谊，彭艳梅，王实强，杨 瑛*

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南省中医药研究院中药研究所，湖南 长沙 410013）

HPLC测定山银花药材中常春藤皂苷元的含量

刘玉琴1，2，谢 谊2，彭艳梅2，王实强2，杨 瑛1*

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南省中医药研究院中药研究所，湖南 长沙 410013）

目的 建立山银花药材中的常春藤皂苷元含量的测定方法。方法 以盐酸-乙醇溶液为水解溶剂，山银花样品加热回流4 h，再用三氯甲烷萃取；采用HPLC，以Waters Symmetry C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，甲醇-0.4%冰醋酸水溶液（80∶20）为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，检测波长为210 nm，测定常春藤皂苷元含量。结果 山银花中常春藤皂苷元的线性范围为2～12 μg，平均加样回收率99.0%，RSD为1.9%。不同产地山银花的常春藤皂苷元含量差异较大，湖南隆回野生的含量高达2.8%，而云南、贵州产的未检出。结论 所建立方法操作简便、准确、可靠、重复性好，可用于山银花药材中常春藤皂苷元的含量测定。

山银花；常春藤皂苷元；酸水解；含量测定；高效液相色谱法

山银花是我国常用的一味传统中药材，从2005年版《中华人民共和国药典》开始，将金银花与山银花分列为两项，规定金银花的植物来源只有忍冬1种；山银花植物来源有3种，而2010年版《中华人民共和国药典》又新增了1个品种，故山银花植物来源一共有4种， 分别为忍冬科植物灰毡毛忍冬 Lonicera macranthoides Hand-Mazz.、 红腺忍冬 Lonicera hypoLauca Miq.、华南忍冬 Lonicera confuse DC.或黄褐毛忍冬Lonicera fuLvotomentosa Hsu et S.C.Cheng，其为上述4种植物的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、疏散风热的功效，常用于热毒血痢、风热感冒等[1]。

山银花所含化学成分多样，主要含黄酮类、有机酸类、苷类和挥发油类等[2-3]。其中苷类成分主要为常春藤皂苷类，此类成分是山银花中除绿原酸类成分之外所含的主要药效成分，故2010年版《中华人民共和国药典》在2005年版的基础上中增加了灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙作为山银花药材的质量评价指标，这两种皂苷均属于常春藤皂苷，由于这两种皂苷只有未端紫外吸收，药典采用蒸发光散射检测器（ELSD）测定这两种皂苷的含量。本研究拟用HPLC测定山银花药材中皂苷经酸水解后得到的常春藤皂苷元的含量，以间接控制山银花药材中总三萜皂苷的含量。现将结果报道如下。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器

LC-10AT高效液相色谱仪和SPD-10AVP紫外可见检测器(日本岛津公司)；N2000双通道色谱工作站 (浙江大学智能信息工程研究所)；AE240型电子分析天平（梅特勒-托利多公司）。

1.2 对照品与药材

常春藤皂苷元对照品 （中国食品药品检定研究所，供含量测定用，批号：111733-201205）；山银花药材：2批采于湖南隆回，经湖南省中医药研究院中药研究所生药室鉴定，为忍冬科植物灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.的干燥花蕾或带初开的花；另7批购于湖南长沙、广西、四川、云南及贵州等地药房，种属不详；样品来源见表2。

1.3 试剂

甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：WatersSymmetryC18(150 mm× 4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.4%冰醋酸水溶液（80∶20）；检测波长：210 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：10 μL。对照品与供试品色谱图见图1。

图1 常春藤皂苷元对照品（A）和山银花药材（B）的HPLC图

2.2 供试品溶液的制备

取山银花药材粉末 （过四号筛）0.2 g，精密称定，置 100 mL锥形瓶中，精密加入 50%乙醇50 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL于100 mL圆底烧瓶中，加入浓盐酸3 mL，加热回流4 h，静置，冷却后，转移至分液漏斗中，三氯甲烷提取6次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，用甲醇定容，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的制备

取常春藤皂苷元对照品10.0 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得常春藤皂苷元对照品储备液（1.00 mg/mL）。精密量取该储备液适量，用甲醇稀释成浓度为500 μg/mL的溶液，即得。

2.4 线性关系的考察

精密量取对照品储备液2、4、6、8、10、12 μL，按照“2.1”项下色谱条件分别进样测定，记录各色谱峰面积，以峰面积（Y）对进样量（X，μg）进行线性回归，得回归方程为：

常春藤皂苷元在2~12 μg线性范围内与峰面积成良好线性关系。

2.5 精密度试验

精密量取对照品溶液（500 μg/mL）10 μL，按照“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，测定，记录各次峰面积。结果得峰面积的RSD为0.9%，表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一份（湖南隆回种植）山银花药材粉末（过四号筛）按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10 h精密量取10 μL进样测定，记录各次峰面积，计算得常春藤皂苷元峰面积的RSD为1.1%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一份（湖南隆回种植）山银花药材粉末（过四号筛）6份，每份0.2 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密量取各溶液10 μL，注入液相色谱仪，按外标法计算常春藤皂苷元的含量。6份样品中常春藤皂苷元的平均含量为21.3 mg/g，其RSD为1.9%，表明方法的重复性良好。

2.8 加样回收试验

取已知含量 （湖南隆回种植）的山银花粉末6份，每份约0.1 g，精密称定，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液 （酸水解时精密加入对照品适量），精密量取10 μL，注入色谱仪，记录常春藤皂苷元峰面积，计算回收率，结果见表1。

表1 回收率试验结果

2.9 样品测定

取所收集的9批不同产地的山银花药材，每批各2份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液和“2.1”项下方法测定，以干燥品计算，得样品中常春藤皂苷元的平均含量，结果见表2。

表2 9批山银花中常春藤皂苷元含量 （n=2）

3 讨论

样品处理方法的选择：硫酸酸水解[4]：采用2 mol/mL的硫酸溶液对山银花样品中的皂苷进行水解，再用三氯甲烷为溶剂索氏提取常春藤皂苷元。测得的常春藤皂苷元含量较高，提示该法对常春藤皂苷元的提取较为完全，但是此法较费时，整个过程历时10 h左右；盐酸-乙醇水解，石油醚（60～90℃）萃取：此法测得的常春藤皂苷元含量较硫酸水解的低得多。盐酸-乙醇水解，三氯甲烷萃取：此法测得的常春藤皂苷元含量与硫酸水解的接近；盐酸-乙醇水解-二氯甲烷萃取：此法测得的常春藤皂苷元含量最低。从操作是否简便、时间长短及对皂苷元提取完全与否等方面综合考虑，本实验采用盐酸-乙醇水解皂苷，再采用三氯甲烷萃取皂苷元，采用此法常春藤皂苷水解较为彻底，对皂苷元的提取也比较完全，且操作相对较简便，耗时较少。

流动相的筛选：本实验对甲醇-水、甲醇-冰醋酸水溶液这两种流动相系统进行了比较筛选，甲醇-水系统无论怎样调节两者比例均未得良好峰形的峰，而换用甲醇-0.4%冰醋酸水溶液系统作为流动相时得到的常春藤皂苷元峰形好，柱效高，推测与常春藤皂苷元结构中含有羟基和羧基有关，故经试验最终选定甲醇-0.4%的冰醋酸水溶液作为本实验的流动相。

测定波长的选择：常春藤皂苷元在205 nm波长处有最大吸收，但由于甲醇的截止波长为205 nm，选用此波长来检测时溶剂有吸收，对测定造成干扰，故选用210 nm作为测定波长，以保证测定结果的准确性。

本次试验收集的山银花药材分别来自湖南、广西、四川、贵州、云南5个省9批样品，常春藤皂苷元含量测定结果显示，来源于不同省的山银花的含量具有较大的差异，湘产的山银花含量较高，而在云南、贵州产的未检测出常春藤皂苷元。

2010年版《中华人民共和国药典》采用蒸发光散射检测器来测定山银花中2种皂苷的含量，实验操作不方便，需配置高压氮气或空气，设备较昂贵，使用成本高，且实验过程中产生的废气有害，加之其检测的灵敏度较紫外检测器的低。而本文建立了RP-HPLC测定山银花中常春藤皂苷元含量，操作简便，测定结果准确，方法重复性好，可作为山银花质量控制的有效方法。

[1]国家药典编辑委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010：28-29.

[2]粟时颖，郑 兴，廖端芳.山银花研究进展[J].南华大学学报，2009，37(6)：744.

[3]王志萍，邓家刚，王 勤，等.山银花研究的最新进展[J].广西中医学院学报，2008，11(4)：59-60.

[4]马双成，刘 燕，毕培曦，等.RP-HPLC法测定金银花药材中常春藤皂苷元及齐墩果酸的含量[J].药物分析杂志，2006，26(7)：885-887.

（本文编辑 徐爱良）

HPLC Determination of Hederagenin in Flos Lonicerae Confusae

LIU Yuqing1,2,XIE Yi2,PENG Yanmei2,WANG Shiqiang2,YANG Ying1*
(1.Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China; 2.Research Institute of Chinese Medicine,Hunan Academy of CM,Changsha,Hunan 410013,China)

ObjectiveTo establish a new method for the determination of hederagenin in Flos Lonicerae Confusae.MethodsThe herb was hydrolyzed with hydrochloric acid-ethanol for 4 hours at 80℃ and the hederagenin was extracted with chloroform and analyzed by HPLC.The Waters Symmetry-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）was used with the mobile phase of methanol-0. 4%glacial acetic acid(80:20),the flow rate was 1.0 mL/min,the column temperature was 30℃, the detected wavelength was 210 nm.Results The linear range of hederagenin was 2～12μg,the recovery rate was 99.0%,RSD was 1.9%.The content of hederagenin in Flos Lonicerae Confusae was varied with growing areas.The content of hederagenin of wild species from Longhui of Hunan province is up to 2.8%,while the hederagenin of the species from Yunnan and Guizhou province has not been detected.ConclusionThe developed method is convenient,precision and repeatability,which can be used to determine the content of hederagenin in Flos Lonicerae Confusae.

Flos Lonicerae Confusae;hederagenin;acid hydrolysis;content determination;HPLC

*杨 瑛，女，研究员，E-mail：fanfeihe@126.com。

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.03.008.028.03

2013－10－27

长沙市科技局科技攻关资金专项资助(K1203019-31)；湖南省属科研机构技术创新发展专项资助（2012TF1005）。

刘玉琴，女，在读硕士研究生，研究方向：药物化学。

·名医撷华·