尤冬春 ，谢义松 *，肖四旺，朱建华 ，陈孟交 ，孙国荣 ，郑先波

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005）

骨质疏松症属于中医学的 “骨痹”、“骨痿”、“骨缩病”等范畴，是最常见的老年性疾病之一，严重影响着老年人的生活质量，所以骨质疏松的防治已成为当今的医学热点之一[1]。根据中医“肾主骨”的理论，临床上采用补益肝肾、健脾益气的治法组方治疗骨质疏松症及相关并发症取得了较好的疗效。本实验采用卵巢切除所诱导的骨质疏松大鼠为模型，通过观察虎潜丸干预对去卵巢大鼠骨密度及骨组织形态的影响，为其防治骨质疏松提供一定的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 6个月龄大SPF级雌性SD大鼠40只，体质量200～250 g，由湖南中医药大学实验动物中心提供实验动物许可证号：SCXK（湘）2011-0003。

1.1.2 药物 虎潜丸由酒炒黄柏、酒炙龟甲、酒炒知母、熟地黄、陈皮、白芍、锁阳、炙狗骨(替代虎骨)、干姜9味中药组成，其提取的药物，含生药量0.35 kg/L(由湖南中医药大学第二附属医院制剂室提供)；雌激素尼尔雌醇片由上海华联制药有限公司生产，规格：1 mg/片，批号：961001。

1.1.3 仪器 双能X线骨密度测量仪，美国HOLOGIc公司产品，QDR4000型；JY3002型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；LEICA DM LB2型双目显微镜，德国LEICA公司产；Motic B5显微摄像系统，麦克奥迪实业集团公司；S2-93自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂；Shandon325型石蜡切片机，英国Shandon公司产。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 所有SD大鼠喂养在恒温、恒湿的清洁环境中，环境温度为（25±1）℃，湿度为70%，每天12 h光照/黑暗，进食大鼠标准饲料和净化水。饲养1周后，将40只大鼠随机分为模型组、雌激素组、虎潜丸组和假手术组，每组10只。

1.2.2 造模[2]采用10%水合氯醛溶液对SD大鼠按0.33 mL/100 g体质量腹腔注射进行麻醉。麻醉生效后，手术组大鼠采用背侧入路（肋弓下第3腰椎旁开0.5 cm处）摘除双侧卵巢造模，假手术组采用相同入路仅切除卵巢周围少量脂肪组织。切口内滴入少量青霉素水溶液，分层缝合手术切口。术后分笼饲养，用80 U单位青霉素注射液腹腔注射3 d抗感染。

1.2.3 给药剂量及方法 术后4周，从造模组及假手术组中随机各选出5只大鼠行活体骨密度检查，以确定造模成功。在确定造模成功后，各组大鼠进行灌胃给药治疗，灌胃给药容积为20 mL/（kg·d），虎潜丸组给予虎潜丸煎剂浓缩液按 7 g/（kg·d）灌胃，药物以蒸馏水定容至所需浓度，每日1次；雌激素组给予尼尔雌醇 1 mL/（kg·d）灌胃，使用前配成混悬液(浓度为 0.167 mg/mL)，1 次/周，其余时间予蒸馏水20 mL/（kg·d）灌胃。假手术组及模型组给予蒸馏水按20 mL/（kg·d）灌胃。灌胃中雌激素组与虎潜丸组各死亡1只。灌胃12周后断头处死各组大鼠，取出各组大鼠脊柱骨、一侧股骨。

1.3 检测指标

1.3.1 骨密度测量 采用双能X线骨密度测量仪测定大鼠的全身骨密度、全部腰椎骨密度（由湖南中医药大学第二附属医院提供仪器）。

1.3.2 病理组织学观察 将剥离的大鼠股骨脱钙、石蜡切片、HE染色后，显微镜观察。

1.4 统计学分析

用SPSS 16.0软件对所有数据进行分析，计量资料用“”表示，符合正态分布及方差齐性行方差分析（ANOVA），方差不齐者采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠骨密度比较

干预12周后，模型组大鼠的骨密度低于假手术组，其差异具有统计学意义（P＜0.05），说明骨质疏松大鼠模型已建立。虎潜丸组及雌激素组大鼠骨密度均高于模型组，其差异具有统计学意义（P＜0.05），说明两种治疗方式均有治疗效果；虎潜丸组与雌激素组大鼠骨密度相比较差异无统计学意义（P＞0.05）。各组骨密度比较见表1。

表1 治疗12周后各组大鼠骨密度的比较 g/cm2）

表1 治疗12周后各组大鼠骨密度的比较 g/cm2）

注：与模型组比较*P＜0.05；与假手术模型组比较#P＜0.05。

组 别假手术组模型组雌激素组虎潜丸组例数10 10 9 9全身骨密度0.129±0.014 0.115±0.009#0.128±0.011*0.127±0.013*腰椎骨密度0.205±0.034 0.171±0.036#0.205±0.030*0.210±0.028*

2.2 对去卵巢大鼠股骨病理组织的影响

模型组大鼠股骨干髓端病理切片检查显示骨小梁稀疏、断裂，排列紊乱，骨皮质疏松，呈蚕食样及葱皮样改变，骨髓腔扩大。假手术组骨皮质可见少许蚕食样改变，骨小梁较细，排列较为一致。虎潜丸组及雌激素组骨组织病理切片均示骨小梁较粗，排列整齐，骨髓腔大小正常，骨皮质致密，边缘整齐。提示虎潜丸及雌激素可以明显改善去卵巢骨质疏松大鼠骨组织显微结构的病理变化。结果见图1。

图1 各组大鼠股骨切片显微观察图（HE染色×40）

3 讨论

切除卵巢的大鼠是研究绝经后骨质疏松发病机制和观察药物疗效的成熟的动物模型[2]，而骨密度测定是研究骨质疏松和评价药效的重要手段，被认为是目前骨质测量的“金标准”[3]。本次实验中，造模4周后手术组的骨密度呈下降趋势，从而确定造模成功。整个生命活动中骨都具有新陈代谢的活性。破骨细胞不断的清除旧的矿物质，与此同时成骨细胞形成类骨质并矿化[4]。成骨细胞的产生是体内多种调控因素作用的结果，有研究表明雌激素作用于成骨细胞产生细胞因子及基质金属蛋白酶，进而影响破骨细胞的活性，促进成骨细胞的增殖与分化，维持其骨密度[5]。骨显微结构和骨密度改变是评价骨强度变化的指标[6]，实验中观察到模型组大鼠骨小梁完整性差、断裂，骨密度降低，符合骨质疏松症模型。虎潜丸组和雌激素组大鼠骨小梁排列较整齐，连接成网，面积、密度无明显减少，表明虎潜丸和雌激素对去卵巢大鼠骨量的丢失，有一定的预防效果。从实验数据中可以看出虎潜丸能提高去卵巢大鼠的骨密度，且对骨组织的影响与雌激素组十分相似，其机制是虎潜丸中的有效成分，作用于成骨细胞，使其增殖、分化和代谢，并促使成骨细胞合成、分泌多种蛋白质和调节因子，从而引起局部类骨质矿化，起到维持骨代谢平衡的作用。

虎潜丸方是补肾经典方，根据中医标本兼治的原则建立，有滋阴降火、强壮筋骨的功效，主治精血不足，筋骨痿弱。方中黄柏、龟板、知母、熟地黄滋补肝肾，壮肾水而滋阴；陈皮、白芍、锁阳、虎骨（现以狗骨代替）、干姜补肾强筋壮骨，兼理气和中，使补而不滞。现代药理研究表明，虎潜丸有抗炎、镇痛、抗疲劳等作用，可以促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化，可有效地治疗骨质疏松症[7]。也有研究表明[8]，虎潜丸提高了肾虚患者的骨密度，且骨密度的升高与调节皮质醇、性激素有关。

中药虎潜丸治疗去卵巢大鼠后，骨密度较治疗前显著增加，实验证实了中药虎潜丸的疗效。但虎潜丸治疗骨质疏松症的作用机制在本实验中没有涉及，只能初步推测可能与雌激素的作用机制相关，拟在下一步实验中进一步研究。

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[5]刘红光，区品中，吴波以，等.雌激素及雄激素对去睾丸大鼠骨质疏松形成的干预研究[J].中国骨质疏松杂志，2003，9(2)：97-101.

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