阮尚全, 宋秋菊, 何慧蓉, 张 裕, 罗大英, 兰子平*

（1.内江师范学院 化学化工学院,四川 内江641112；2.内江师范学院 四川省高等学校果类废弃物资源化重点实验室,四川内江641112）

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）为无患子科荔枝属常绿乔木,是热带和亚热带的特色水果,主要分布于我国广东、广西、福建、台湾以及四川的合江县等地区.合江荔枝产量占四川全省的90%以上,2012年产量已达1 100多万kg.荔枝壳为荔枝的外果皮,含有如花青素、红色素、黄酮类、酚酸和多糖类等多种活性成分,具有很高的药用价值［1］.黄酮是广泛存在于植物细胞内的细胞次生代谢、具有酚羟基的化合物,由于其自身被氧化而具有抗氧化作用,在体内和体外都具有较强的抗氧化性,对人的毒副作用小,因而受到了国内外学者的高度重视［2-3］.纤维素酶能催化破坏细胞壁,改变细胞壁的通透作用,利于细胞内含物渗出,同时其具有专一性,不破坏其他物质,保持其他物质的原生结构,因此与传统提取方法相比,具有无毒、反应条件温和及催化活力可调控制等优势,在植物成分的提取中得到了广泛应用［4］；超声波在介质中传播时产生的空化作用、机械效应、热效应、化学效应,可提高目标物从固相转移到液相的传质速率,提高提取产率,同时不影响大多数有效成分的生理活性［5-6］.本文将纤维素酶和超声波的优点相结合,以四川合江县产的荔枝壳为原料,建立荔枝壳中黄酮提取的新方法,并对提取物清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力进行了初步实验,对提高荔枝壳的综合利用价值具有重要意义.

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

1.1.1 主要仪器 T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析）、KQ-400KDB超声波清洗器（江苏昆山）、TD-5台式低速离心机（四川蜀科）、DFT-100型中药粉碎机（温岭）、电热鼓风干燥箱（重庆银河）、AE240电子分析天平（梅特勒-托利多）、HH-S2恒温水浴锅.

1.1.2 试剂 纤维素酶（11 kU/G）,芦丁（BR）,三羟甲基氨基甲烷（BR）,亚硝酸钠、硝酸铝、无水乙醇、氢氧化钠等均为分析纯.

1.2 实验方法

1.2.1 提取工艺流程 荔枝壳清洗→烘干粉碎→溶剂浸泡酶解→超声提取→分离显色→测定.

1.2.2 黄酮的提取与测定 试验用荔枝壳采自于四川合江县,材料洗净低温烘干、粉碎.准确称取一定量荔枝壳粉于提取瓶中,按照一定固液比加入乙醇和纤维素酶酶解,在一定的温度下超声提取,离心分离上层清液定容,按照文献［7］方法测定吸光度值,根据标准曲线回归方程得到提取液浓度,计算总黄酮提取率.

1.2.3 芦丁标准曲线的绘制 准确称取0.020 0g芦丁标准品溶解于体积分数30%的乙醇中,定容于100 mL容量瓶中,得到0.20 mg/mL标准液.准确移取标准液 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00 mL 于25 mL 比色管,按文献［7］方法加入质量分数5%的NaNO2溶液1.0 mL,6 min后加入质量分数10%的硝酸铝溶液1.0 mL,放置6 min,加质量分数4%NaOH溶液10.0 mL,用蒸馏水定容,在511 nm处测定吸光度,绘制标准曲线.

1.2.4 单因素实验 准确称取荔枝壳粉1.000 g于100 mL提取瓶中,做以下因素试验:固定料液比为1∶30、pH5、0.06%的纤维素酶、50℃酶解 80 min、280 W超声波提取20 min条件,乙醇体积分数分别为10%～80%；固定乙醇体积分数为40%、0.06%的纤维素酶、pH5、50℃酶解80 min、280 W超声波提取20 min条件,料液比分别为1∶20～1∶80；固定乙醇体积分数为40%、料液比1∶30、pH5、50℃浸泡80 min、280 W超声波提取20 min条件,纤维素酶用量分别为0.00%～0.30%；固定乙醇体积分数为40%、料液比1∶30、0.06%的纤维素酶、pH5、酶解80 min、280 W超声波提取20 min条件,酶解温度为30～70℃；固定乙醇体积分数为40%、料液比1∶30、0.06%的酶用量、pH5、280 W超声波提取20 min条件,50℃酶解20～80 min；固定乙醇体积分数为40%、料液比1∶30、0.06%的纤维素酶、50℃酶解80 min、280 W超声波提取20 min条件,pH值分别为3～7；固定乙醇体积分数为40%、料液比1∶30、0.06%的纤维素酶、pH5、50℃恒温酶解80 min、超声波提取20 min条件,超声波功率分别为160～400 W.

1.2.5 抗氧化性实验 对·OH清除能力采用水杨酸法,参照文献［8］方法,在反应体系中加入荔枝壳提取物,利用H2O2与Fe2+混合产生·OH,在反应体系中加入水杨酸有效地捕捉·OH产生有色产物,产物在510 nm波长处测定其吸光度.O2-·清除的实验采用邻苯三酚自氧化法,参照文献［9］利用邻苯三酚在弱碱性条件下自身氧化产生O2-.和有色中间产物,在反应体系中加入荔枝壳提取物,O2-·的生成受到抑制,邻苯三酚自氧化受阻,在420 nm波长处测定其吸光度.

2 结果与讨论

2.1 标准曲线实验结果实验测得标准曲线回归方程为:吸光度 A ＝0.0114c-0.0019,c/（μ g/mL）为芦丁质量浓度,复相关系数R2＝0.9993,芦丁质量浓度在8.0～56.0 μ g/mL范围内线性关系良好,如图1所示.

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响 总黄酮提取率随着乙醇体积分数的升高而增加,乙醇体积分数为50%时达到最高,随后逐渐降低.这是由于黄酮溶解于乙醇,乙醇体积分数增大利于黄酮的溶出,致提取率增大.但过高的乙醇体积分数使体系介质发生的改变可能降低了超声波功能作用,致使黄酮的提取率降低,如图2所示.

2.2.2 料液比对黄酮提取率的影响 总黄酮提取率随着乙醇体积分数的升高而增加,料液比为1∶60时达到最高,随后变化不大,如图3所示.

2.2.3 酶用量对黄酮提取率的影响 总黄酮提取率随着酶用量的升高而增加,在酶用量为0.12%时达到最高,随后逐渐降低.原因是纤维素酶破坏原料的细胞壁,让黄酮更易扩散到溶剂中,以提高提取率；过高的酶量会使总黄酮的提取率减小,这是由于底物配比对酶解作用有较大的影响,同时纤维素酶的加入也会加大大分子物质（如:果胶等）的溶出,对黄酮产生吸附,致总黄酮得率降低,如图4所示.

2.2.4 酶解温度对黄酮提取率的影响 总黄酮提取率随温度的升高而增加,温度为60℃时最高,随后逐渐降低.这是由于温度越高,对原料作用越充分,提取率提高；而酶有一个最适作用温度,当温度过高时,酶的活性会降低,黄酮也会分解,故提取率降低,如图5所示.

2.2.5 酶解时间对酮提取率的影响 总黄酮提取率随着酶解时间的增加而增加,酶解时间为80 min时提取率最高,然后逐渐降低.原因是提取时间增长,有利于黄酮的溶出,提取率增大；但过长的时间也会导致黄酮氧化分解,且乙醇也会挥发,导致黄酮提取率会降低,如图6所示.

2.2.6 酶解pH值对黄酮提取率的影响 总黄酮提取率随着pH升高而增加,pH＝5时最大,随后逐渐降低.是由于纤维素酶的活性受pH影响,在黄酮提取过程中pH值为5时是纤维素酶的最适酸度,pH值过低和过高时,酶的活性会逐渐降低,故黄酮提取率会也会随之受到影响,如图7所示.

2.2.7 超声波功率对黄酮提取率的影响 总黄酮提取率随着超声波功率的升高而增加,超声波功率为240 W处达到最高,随后逐渐降低.超声波功率的增大,有利于黄酮的溶出,但能量过高,也会导致黄酮分解,如图8所示.

2.3 正交试验及结果在单因素实验结果的基础上,其他因素为最佳的条件下,主要考查乙醇体积分数、料液比、酶用量、酶解时间对提取率影响进行正交试验设计.取3个水平按L9（34）进行正交实验,以黄酮提取率为评价标准,确定最佳工艺.实验结果见表1,方差分析见表2.

表1 L9（34）正交实验设计及结果Table 1 L9（34） orthogonal experimental design and results

由表1和表2可知:乙醇体积分数、料液比、酶解时间、酶用量等因素均对荔枝壳中总黄酮的提取有影响；由极差R可知,各因素对黄酮提取率的影响主次顺序为:A＞C＞B＞D；从荔枝壳中提取黄酮的工艺条件最优组合为A2B3C3D2,即乙醇体积分数50%,料液比1∶70,提取时间为100 min,酶用量为0.12%为最佳提取条件.方差分析知:乙醇体积分数及酶解时间对黄酮提取率有影响具有显著性,料液比及酶用量对黄酮提取率有影响但不具显著性.为进一步验证正交试验的结果及重现性,在最优条件下进行4次平行实验,荔枝壳的黄酮提取率分别为:5.145%、5.177%、5.016%、5.048%,平均提取率为5.10%.

表2 正交试验的方差分析Table 2 The variance analysis of the orthogonal experiment

2.4 抗氧化性试验结果

2.4.1 清除·OH活性 实验结果为:提取物在2.9～29 μ g/mL范围内,对·OH 清除率为 19.89% ～66.67%,如图9所示.

2.4.2 清除O2-·活性 实验结果为:提取物在29～116 μ g/mL 范围内,对 O2-·清除率为13.41%～50.227%,如图10所示.

3 结论

本文采用单因素联合正交试验设计,建立以超声波协同酶法提取了荔枝壳中的总黄酮方法,并对提取产物实验了清除·OH和O2-·活性测定,得出提取荔枝壳中黄酮的最佳工艺条件为:乙醇体积分数50%,料液比1∶70,提取时间为100 min,酶用量为0.12%,荔枝壳中黄酮类物质的提取率为5.10%.提取产物对O2-·和·OH自由基具有较强的清除能力.

本法作为一种天然产物活性成分分离提取的新技术,具有条件温和、快速的特点.将超声波和纤维素酶的特点综合利用,对提取荔枝壳中的黄酮具有一定的适用价值.荔枝壳中黄酮物质的分离纯化等问题有待进一步探究.

致谢内江师范学院自然科学基金（12NJZ02）对本文给予了资助,谨致谢意.

［1］杨宝,赵谋明,李宝珍,等.荔枝壳活性成分提取工艺条件研究［J］.食品与机械,2004,20（6）:28-30.

［2］裴凌鹏,惠伯棣,金宗濂.黄酮类化合物的生理活性及其制备技术研究进展［J］.食品科学,2004,25（2）:203-207.

［3］赵继红,梁宇,颜达予.黄酮类化合物抗氧化活性的结构因素［J］.北方工业大学学报,2001（1）:36-44.

［4］闫训友,刘志敏,史振霞,等.纤维素酶在食品工业中的应用进展［J］.食品工业科技,2004,25（10）:140-142.

［5］魏燕华,成差群,谭秀芬.超声波提取法与索氏提取法提取化橘红中柚皮苷的比较［J］.中国药业,2009（18）:47-48.

［6］付伟丽,黄作喜,唐正义,等.铁皮石斛多糖研究进展［J］.内江师范学院报,2011,26（4）:40-44.

［7］张海悦,王黎兵,郭新力.狭叶荨麻总黄酮的测定［J］.食品科技,2007（12）:181-183.

［8］张春生,方玉梅,王毅红,等.野生鱼腥草黄酮化合物对羟基自由基的清除作用［J］.食品科技,2009,34（6）:188-190.

［9］海平,苏雅乐其其格.蒙家小白蒿中总黄酮的提取及其抗氧化活性研究［J］.中国实验方剂学杂志,2012（3）:59-63.