罗 莉，何 松，罗 娜，彭明利

（1.重庆市渝北区人民医院消化内科 401120；2.重庆医科大学附属第二医院消化内科 400010；3.重庆医科大学附属第一医院急诊科 400016；4.重庆医科大学病毒性肝炎研究所 400016）

乙型肝炎病毒（HBV）感染是一种世界性的传染病，全球约有3.5亿 HBV慢性携带者，严重危害人类健康［1］。而主要组织相容性复合物MHC－Ⅰ限制的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在预防、控制、清除HBV感染中起着核心作用［2－3］。已有研究运用结核杆菌热休克蛋白70（TB.HSP70）作为表位肽载体制备疫苗免疫治疗 HBV感染［2］。HBV18－27核心肽的CTL表位在大多数HBV病毒株中高度保守，与HLA－A2.1e有高度亲和力，能与几种 HLA－A2的亚型产生交叉反应［4］。已有研究表明，HSP70－HBcAg（18－27）－CTL 融合蛋白和HSP70－HBcAg（18－27）－CTL复合物可有效诱导 HBV 特异性细胞免疫反应，HBcAg（18－27）的增殖活性较弱，它对淋巴细胞的特异性杀伤作用影响不大［2］。因此，本研究借助结核杆菌HSP70作为表位肽载体，设想将 HBcAg HLA－A2限制性CTL表位 HBcAg（18－27）融合到TB.HSP70的C端，并引入Th和B表位，应用Pichia pastoris酵母分泌表达目的蛋白，体外考察疫苗对慢性HBV感染者外周血淋巴细胞和外周血来源的树突状细胞的作用，进行免疫学功能研究，为慢性乙型肝炎（CAH）的治疗开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料 Pichia pastoris GS115表达宿主菌、表达质粒pPIC9和pPIC9K、重组人白细胞介素（IL）－2为Invitrogen公司产品；含TB.HSP70基因的表达载体H37Rv、HepG2.2.15细胞为本实验室构建、保存；限制性内切酶（大连宝生物公司）；ATP－agarose（美国Sigma公司）；辣根酶标记的羊抗鼠IgG抗体（北京康为公司）；鼠抗－TB.HSP70单克隆抗体、FITC标记的鼠抗CD1a、CD86、HLA－DR单克隆抗体及同型对照抗体（Sigma公司）；FITC标记的鼠抗CD40单克隆抗体（Abcam公司）；检测IL－12p70、IL－1β、肿瘤坏死因子－α（TNF－α）和干扰素－γ（IFN－γ）的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（深圳晶美公司）；……