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外源NGF促进大鼠皮肤创面模型损伤修复的机制研究

2014-09-25李政懋吕辰杨选鑫张宏宇

上海医药 2014年17期
关键词:细胞增殖

李政懋+吕辰+杨选鑫+张宏宇

(温州医科大学药学院分子药理研究中心 温州 325035)

摘 要 目的:探究外源NGF对大鼠创面的治疗作用及机制。方法:在SD雄性大鼠的背部脊柱的两侧手术切开形成两个2 cm x 2 cm的伤口,右边伤口处给予20 mg/ml NGF 1 ml,左边伤口给等量生理盐水作为对照组。隔天给药到第14天(第14天停止给药),分别于d3、d7、d14统计创面伤口愈合率,并取这3个时间点的组织用免疫组化的方法检测转化生长因子 ( transforming growth factor-β1,TGF-β1)、CD68-阳性巨噬细胞、增殖性细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF-1)的表达量。结果:NGF组的创面愈合率明显高于生理盐水组,并且NGF组TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的蛋白表达量也显著高于生理盐水组(P<0.05)。结论:外源NGF具有促进创面愈合作用,其机制可能与趋化炎症因子、加快血管生成、促进PCNA、TGF-β1的表达相关。

关键词 神经生长因子 创面修复 炎症趋化因子 血管生成 细胞增殖

中图分类号:R628 文献标识码:A 文章编号:1006-1533(2014)17-0051-04

Study on the mechanism of exogenous nerve growth factor

in accelerating the wound healing in the model of rats with skin damage

LI Zhengmao, LV Chen, YANG Xuanxin, ZHANG Hongyu*

(The Institute of Molecular Pharmacology, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China)

ABSTRACT Objective: To study the therapeutic effect of nerve growth factor (NGF) on wound healing in rats and its mechanism. Methods: Two full thickness wounds (2 cm x 2 cm) extending through the panniculus carnosus were made on both sides of the back spine in SD male rats. The right incision (designated as an experimental group) was treated with 1 ml of NGF (20 mg/ml, dissolved in 0.9% sterile saline) every other day till 14th days while the left incision (designated as a control group) with equal amounts of 0.9% sterile saline. The rates of wound healing were recorded at day 3, 7 and 14 and the expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1), CD68+ macrophages, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and vascular endothelial growth factor (VEGF-1) in wound tissues sampled at day 3,7 and 14 were detected by immunohistochemistry staining. Results: The rates of wound healing and the protein expression of TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1 were obviously higher in the experimental group than in the control group (P<0.05). Conclusion: The mechanism of NGF in the promotion of wound healing might be related to the chemotactic factor, the promotion of angiogenesis and the expression of PCNA and TGF-β1.

KEY WORDS nerve growth factor; wounds healing; chemotactic factors; vasculogenesis; cell proliferation

神经生长因子(NGF)最早于1953年被Levi-Montalcini发现,并因此获得了1986年诺贝尔医学生理学奖。目前多用的是鼠源性NGF,包含a、b、g 3个亚单位,活性区是b亚单位,由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体[1] 。研究发现NGF具有:①促进神经元分化再生[2] ;②维持神经元的存活、生长、发育,尤其是对多巴胺能神经元的保护作用;③促进神经元的修复[3] ;④促进创口的表皮细胞、真皮细胞的生长,使其修复愈合[4] 。

皮肤创伤是一个复杂的病理过程,包括炎症反应、细胞增殖、创面收缩、胶原代谢、新生血管形成及增殖、感觉末梢神经的恢复等基本过程,临床表现为局部炎症反应、细胞增殖分化及肉芽组织形成、组织重建三个阶段[5] 。大量研究证实:创面愈合的各阶段均有NGF参与并发挥重要作用。本研究将通过构建大鼠皮肤创伤实验模型,给予外源NGF治疗,在不同的时间点统计伤口愈合率,通过免疫组化染色对TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的蛋白表达量进行检测分析,探讨NGF促进皮肤创伤修复的相关机制。

材料与方法

材料

SPF级成年雄性SD大鼠30只,体重200~250 g,购自上海斯莱克实验动物中心(医动字第04-20-3号)。UltraSensitiveTM S-P 超敏试剂盒(福州迈新,产品编号:KIT-9710)。外源性NGF由厦门北大之路生物科技有限公司提供。

方法

动物模型的建立

用8%的水合氯醛对实验大鼠经腹腔注射进行麻醉,麻醉后固定于简易操作台,剪去背部毛发,用碘伏对背部皮肤进行消毒。用剪刀在其背部以脊柱为对称轴的两侧剪两个2 cm x 2 cm的伤口。右侧伤口给20 mg/ml NGF 1 ml,左侧给予等量的无菌生理盐水(0.9%氯化钠溶液)。隔天给药到第14天(第14天不给药)。

创面愈合率的统计

分别于d1、d3、d7和d14量取伤口未愈合面积(用透明的纸画下伤口面积,再将画下的面积复印到坐标纸上,数格计算出面积),计算比较伤口愈合率。伤口愈合率(%)=(开始时伤口面积-取材日伤口面积)/开始时伤口面积×100%[6] 。

皮肤组织处理

1)于d3、d7各处死5只大鼠,d14处理全部大鼠,取其背上创面的全层皮肤,进行石蜡包埋处理,切片厚度为7 mm。

2)通过免疫组化将已经包埋好的组织切片进行染色检测,依次经过二甲苯及不同浓度梯度的酒精进行脱蜡后,在清水中冲洗一段时间,加入3% H2O2浸泡10 min,除去内源性的过氧化氢酶后再加入柠檬酸缓冲液,放入微波炉中加热3 min(温度:95 ℃左右),使抗原的位点暴露出来,冷却至室温后进行血清封闭。再依次进行加一抗、二抗、SABC和由DAB/H2O2/磷酸缓冲液配置的染色液处理。随后加入苏木精中复染,脱水后进行封片,检测TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的蛋白表达量,根据检测结果进一步对NGF是否有促进创面愈合作用作出判定[7-10] 。

结果

创面愈合率

NGF组与生理盐水组在d1、d3、d7、d14的皮肤愈合率见表1,其差异具有统计学意义(P<0.05),表明外源NGF能够加速创面的愈合。

TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的蛋白表达量

TGF-β1是一族多肽类生长因子,可以作用于成纤维细胞,促进细胞增殖分化,抑制细胞凋亡,合成胶原蛋白,并调节创伤中各细胞间的相互作用,加速创面的愈合[7]。TGF-β1抗原表达多少与细胞增殖成正相关,可以反映出细胞的增殖状态。由此推断NGF能促进细胞增殖,从而促进伤口愈合(图1)。

CD68是主要的单核-巨噬细胞抗原,其表达可以反应出巨噬细胞的分布,推测NGF可以诱导炎症细胞在创面的聚集(图1)。

PCNA阳性表达的强弱代表细胞增殖活动的高低,在细胞增殖的启动上起着重要作用,是目前能较好反映细胞增殖状况的指标[8]。表明NGF有利于伤口的愈合(图1)。

VEGF-1作为一种血管生成调节因子,在创伤早期的大量表达有助于伤口的愈合[9-10]。推断NGF可以促进VEGF-1表达,使创面处的血管细胞处于增殖状态,从而加快伤口的愈合(图1)。

讨论

创伤愈合是一个涉及分子、细胞和组织水平的复杂生物学过程。在创面组织损伤修复过程中,细胞因子几乎调控损伤后皮肤再生的全过程,包括细胞趋化、增殖、基质合成与降解、炎症反应等多方面。TGF-β1作为一种大分子复合体作用于成纤维细胞,促进细胞外基质产生并抑制其降解,对细胞增殖、分化起重要调节作用[11]。CD68在伤口炎症反应阶段主要是趋化、聚集炎症细胞,并清除坏死组织及细胞碎片[12] 。PCNA可促细胞增殖,并在细胞生长S期大量表达,故可将其作为评价细胞增殖状态的重要指标[13] 。VEGF-1可直接作用血管内皮细胞,加强血管通透功能,促进血管内皮细胞增殖而形成新血管[14-15] 。以上4种蛋白的作用均在创伤愈合过程中有重大意义。

NGF作为一种神经生长因子,与碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)都是多功能的生物活性多肽,目前在临床创面修复治疗中,bFGF冻干粉已经成为一种重要的生物治疗药物。有文献报道,在切断成年大鼠的坐骨神经后,坐骨神经断端吻合口处会立刻观察到内源性NGF大量表达[5,16] ,表明NGF也会参与细胞的再生修复及伤口愈合的过程。由此推测NGF在创面愈合方面具有与bFGF相似的生物学效应[17]。为进一步探究NGF对皮肤创伤愈合的修复机制,本研究通过外源给予创伤模型NGF,并于不同的时间点对创面的愈合情况进行统计分析,发现NGF组的愈合情况要明显好于生理盐水组,但需要考虑到的一点是,大鼠皮肤与人体皮肤存在着差异,相对而言大鼠对皮肤创面具有更强的修复作用,因此在表1中,NGF组与生理盐水组在d14都有较好的愈合效果。但总体而言,给予NGF后能够显著提高创面修复能力。本文实验还分别对TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的表达量进行检测,发现TGF-β1在d3、d7的表达量明显高于生理盐水组,愈合完全后(d14)表达量有所下降,原因可能是由于NGF组在d14已经达到几乎完全愈合的效果,因此TGF-β1的表达量有所下降,而生理盐水组在d14并未达到完全愈合效果,所以TGF-β1的表达量仍处于一个相对较高的水平。同样地,NGF组的CD68、PCNA、VEGF-1的表达量在d3、d7也显著高于生理盐水组,并在d14相对低于生理盐水组,这表明了NGF的给予会促进这4种蛋白的表达,从而达到加快伤口愈合的生物学效应。另外发现给予NGF后,PCNA在d3的表达要高于d7,推测其原因为大鼠皮肤出现创面时,其机体自身会即刻通过不同的细胞增殖来进行创面的修复,因而在d3其表达量较高。而NGF促进创面愈合的作用很有可能与促进胶原蛋白的沉积、血管的生成、加速伤口处的血液循环,使氧和营养物质能够到达伤口部位,让细胞得到充分的增殖,为伤口愈合提供有利的条件等有关,其具体机制仍有待于进一步的研究探明。

由此可见,NGF在创面修复中潜在的应用价值正在渐渐的凸显出来。继续探究NGF对创面愈合的修复机制,更好地利用NGF自身的生物学特点,将是今后研究的一个重点和方向,也将为临床治疗难愈创面提供新的策略。

参考文献

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(收稿日期:2014-06-10)

由此可见,NGF在创面修复中潜在的应用价值正在渐渐的凸显出来。继续探究NGF对创面愈合的修复机制,更好地利用NGF自身的生物学特点,将是今后研究的一个重点和方向,也将为临床治疗难愈创面提供新的策略。

参考文献

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(收稿日期:2014-06-10)

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(收稿日期:2014-06-10)

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