甘彩霞+袁伟玲+王晴芳+崔磊+梅时勇

摘要:从12个萝卜黑斑病菌(Alternaria sp.)菌株里筛选产孢最多的菌株,从8种培养基(PDA培养基、PSA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、YPD培养基、面粉培养基、豆芽培养基、玉米培养基、杏仁培养基)中筛选其最适合的培养基,研究温度、光照、培养时间对其的影响。结果表明, 在12个菌株中JZHB7菌株产孢最多;豆芽培养基为JZHB7产孢的最佳培养基;JZHB7孢子15 ℃时萌发率高, 0 ℃时萌发率低;JZHB7培养4~7 d菌丝生长较快, 10~13 d生长较慢;日光灯照射培养2 h产孢量多,照射培养24 h产孢量少。

关键词:萝卜黑斑病菌(Alternaria sp.);JZHB7菌株;生物学特性;产孢量;培养基

中图分类号:S436.31文献标识码:A文章编号:0439-8114(2014)10-2312-04

The Biological Characteristics of Radish Alternaria and the Screening of the Medium

GAN Cai-xia,YUAN Wei-ling,WANG Qing-fang,CUI Lei,MEI Shi-yong

(Institute of Economic Crops,Hubei Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430064,China)

Abstract:The bacterial strain with the largest sporulation quantity was chosen from the 12 Alternaria sp. bacterial strains and the optimal medium was selected from 8 media including PDA medium, PSA medium, beef extract peptone medium, YPD medium, flour medium, bean sprouts medium, corn medium,almond medium. The influence of temperature, light, treatment time on sporulation of Alternaria sp. were studied. The results showed that JZHB7 Alternaria had the largest sporulation quantity. Bean sprouts medium was the best medium among the eight kinds of media,JZHB7 Alternaria spores germination reached the maximum at 15 ℃ and the minimum at 0 ℃. JZHB7 Alternaria strains grew fast from 4 d to 7 d and slow from the 10 d to 13 d. Sporulation quantity of JZHB7 Alternaria increased in 2 h and decreased in 24 h.

Key words: radish black spot disease(Alternaria sp.); JZHB7 Alternaria; biological characteristics; sporulation quantity; medium

基金项目:湖北省农业科技创新中心资助项目(2013-620-007-003)

萝卜黑斑病是世界各地萝卜产区的重要病害,不仅危害萝卜而且对其他十字花科蔬菜也具有严重的危害性[1]。十字花科黑斑病由链格孢属(Alternaria)病菌引发,主要由芸薹链格孢(Alternaria brassicae)、芸薹生链格孢(Alternaria brassicicola)、萝卜链格孢(Alternaria japonica)侵染引起[2],链格孢属黑斑病菌在PDA培养基上菌落初为白色,后转为暗灰色。菌丝近无色,有隔,直径 2~8 μm;分生孢子梗一般单生,少数束生。在培养基上分生孢子着生在菌丝的分枝上,在叶片上一般单生,而在PDA培养基上可2~3个串生;在培养基上可形成大的厚垣孢子,一般串生,少数单生,近球形,暗黑褐色,表面光滑,一般直径为菌丝的2~4倍[3]。

本研究主要观察萝卜黑斑病菌的生物学性状,筛选产孢量高的菌株和相应培养基,研究环境温度、光照、培养时间对其的影响,为萝卜抗黑斑病育种奠定一定的理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料

菌种:萝卜主产区黑斑病病样分离培养菌株12株,分别为HB1、HB2、JZHB2、JZHB5、JZHB7、JZHB8、JZHB10、WHHB1、WHHB2、WHHB4、WHHB9、HHB10,于4 ℃冰箱中试管斜面保存。

培养基:PDA培养基、PSA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、YPD培养基、面粉培养基、豆芽培养基、玉米培养基、杏仁培养基,经高压蒸气灭菌(121 ℃,30 min)。具体情况见表1。

1.2试验方法

菌株筛选:在超净工作台上用无菌挑针从各菌种中挑取适量孢子在PDA培养基上倒置培养活化,每一菌株活化3个皿,10 d左右可长出完整的菌丝,转接,20 d后从中选出产孢量最高的菌株。

接种和培养:将选定菌株接种到8种培养基上,每个培养基3个重复。接种完后做好记录,培养皿倒置, 15~20 d培养基表面长满菌丝。将同一培养皿中菌丝用带纱布漏斗过滤,无菌水冲洗定容至40 mL,显微镜检、血球板计数(25格×16格,5点取样),3次重复。确定最佳培养基。

将筛选出的菌株接种到筛选出的培养基上测定不同温度对孢子萌发的影响。温度分别设置为0、15、25、35 ℃,处理10 min, 培养24 h, 3个重复。显微镜检、血球板计数,测定其产孢总数和萌发数,计算孢子萌发率。孢子萌发率=孢子萌发数/孢子总数×100%。

将筛选出的菌株接种到筛选出的培养基上,同一温度下培养4、7、10、13 d,观察菌落特征,测量菌落直径。

将培养9 d后的培养基分别用40 W紫外灯和40 W日光灯照射1、2、8、24 h,测定不同光照及时间对孢子萌发的影响。

2结果与分析

2.1菌株的筛选

活化后的菌株通过PDA培养基培养20 d,观察产孢情况(图1),可见JZHB7在PDA培养基上产孢量最大,显著高于其他菌株(P<0.05,SPSS)。

2.2培养基的筛选

JZHB7菌株在8种培养基上培养20 d的产孢情况见图2。由图2可以看出,菌株JZHB7在面粉培养基和豆芽培养基上产孢均多,产孢量与其他培养基上的产孢量差异显著(P<0.05,SPSS),在豆芽培养基上的产孢量高于面粉培养基,两者差异不显著(P>0.05,SPSS)。

2.3温度对孢子萌发的影响

不同温度条件下JZHB7菌株的孢子萌发情况见图3。JZHB7菌株孢子在15 ℃时萌发率最高,在0 ℃时萌发率最低。在0~15 ℃随温度升高孢子萌发显著增多,在15~35 ℃随温度升高孢子萌发显著减少,说明高温抑制孢子的萌发,4个温度条件下孢子萌发率差异均显著(P<0.05,SPSS)。

2.4培养时间对菌丝生长的影响

在25 ℃时JZHB7菌落的生长状况见图4-图8。从图4可看出,JZHB7菌丝在4~7 d生长较快, 10~13 d生长较慢, 4个测量时间的菌落直径差异均显著(P<0.05,SPSS)。

2.5不同光照对产孢的影响

JZHB7菌株用豆芽培养基培养9 d后用40 W紫外灯及40 W日光灯分别照射1、2、8、24 h, 观察对产孢量的影响(图9)。JZHB7菌株在紫外灯照射下产孢量远低于日光灯,两者差异显著(P<0.05, SPSS)。日光灯照射2 h时产孢最多, 照射24 h产孢最少,但产孢量差异不显著(P>0.05, SPSS)。比较两种光源对黑斑病菌产孢的促进效能,显然日光灯要高于紫外灯。

3小结与讨论

张天宇[4]研究表明,部分链格孢不同种间菌丝形态的差异小,只有在菌丝产生一些特殊结构时才有分类学上的鉴别价值;链格孢属不同种之间在菌落形态、生长速度等方面常有差别,菌落作为种级鉴别特征对个别种有参考价值。在本研究过程中,12种萝卜黑斑病菌在PDA培养基上培养20 d,可以较为明显地观察到菌丝的生长形态和变化,20 d后通过显微镜可以较为方便地统计链格孢的产孢数量, JZHB7菌株在12个菌株中产孢量最高。

肖长坤等[5]筛选出适合黑斑病菌生长的PDA、PSA和SNA 3种培养基,其中在PDA培养基上供试菌株生长速率均比较快,因此PDA培养基是一种适宜用来大量培养黑斑病菌菌丝体的培养基,这也与已有的相关报道结果一致;SNA培养基同样适宜培养,其具有一定的种间选择性和促进产孢的作用,适合用于病原菌分离、纯化和鉴定[6]。

对于链格孢的适宜培养基已有类似报道[7]。本研究发现链格孢JZHB7在多种培养基上能生长,不同的培养基上菌丝生长速率以及菌落形态有较大差异,其中,在豆芽培养基上生长最好,产孢量最大。

JZHB7菌株在0~35 ℃范围内孢子均可萌发;最适孢子萌发温度为15 ℃,此时萌发率最高;0 ℃时萌发率最低;15~35 ℃孢子萌发率随温度上升而降低。这与前人[8-11]的研究结果相似。

JZHB7菌株培养4~7 d生长较快, 10~13 d生长较慢。这与已有的研究结果[12]基本相符。

紫外灯照射不利于JZHB7产孢,日光灯照射2 h产孢最多, 24 h产孢最少。

参考文献:

[1] 郑建秋,胡荣娟,王艳梅,等.秋白菜黑斑病产量损失关键期分析[J].北京农业科学,1994,12(2):39-40.

[2] 吕佩珂,苏慧兰,高振江,等.中国现代蔬菜病虫原色图鉴[M]. 呼和浩特:远方出版社,2008.

[3] 李明远.萝卜链格孢形态学的研究[J].华北农业学报,1993,8(3):98-101.

[4] 张天字.中国真菌志第十六卷 链格孢属[M].北京:科学出版社,2003.

[5] 肖长坤,李勇,李健强.十字花科蔬菜种传黑斑病研究进展[J].中国农业大学学报,2003,8(5):61-68.

[6] 阎淑娟,董金皋,樊幕贞.白菜黑斑病菌营养生长与毒素产生关系的初步研究[J].河北农业大学学报,1998,21(1):23-26.

[7] 李多川,张天宇.链格孢属(丝孢纲)数值分类研究初探[J].真菌学报,1993,12(3):239-246.

[8] 蔡吉苗,李超萍,时涛,等.木薯炭疽病病原鉴定及其生物学特性研究[J].安徽农业科学,2010,38(10):5435-5438.

[9] 任小杰,梁艳,陆金萍,等.上海地区草莓炭疽病病原鉴定[J].植物病理学报,2008,38(3):325-328.

[10] 林清洪,林光荣,刘福平,等.鹤望兰炭疽病的生物学特性及杀菌剂的药效研究[J].福建农业学报,2006,21(3):13-20.

[11] 范晓龙,朱建华,周旭,等.南方红豆杉炭疽病病原鉴定及其生物学特性[J].福建林学院学报,2006,26(2):117-122.

[12] 肖长坤,吴学宏,李健强.白菜黑斑病菌三个种菌株基本培养条件比较[J].菌物学报,2004,23(4):573-579.

2.3温度对孢子萌发的影响

不同温度条件下JZHB7菌株的孢子萌发情况见图3。JZHB7菌株孢子在15 ℃时萌发率最高,在0 ℃时萌发率最低。在0~15 ℃随温度升高孢子萌发显著增多,在15~35 ℃随温度升高孢子萌发显著减少,说明高温抑制孢子的萌发,4个温度条件下孢子萌发率差异均显著(P<0.05,SPSS)。

2.4培养时间对菌丝生长的影响

在25 ℃时JZHB7菌落的生长状况见图4-图8。从图4可看出,JZHB7菌丝在4~7 d生长较快, 10~13 d生长较慢, 4个测量时间的菌落直径差异均显著(P<0.05,SPSS)。

2.5不同光照对产孢的影响

JZHB7菌株用豆芽培养基培养9 d后用40 W紫外灯及40 W日光灯分别照射1、2、8、24 h, 观察对产孢量的影响(图9)。JZHB7菌株在紫外灯照射下产孢量远低于日光灯,两者差异显著(P<0.05, SPSS)。日光灯照射2 h时产孢最多, 照射24 h产孢最少,但产孢量差异不显著(P>0.05, SPSS)。比较两种光源对黑斑病菌产孢的促进效能,显然日光灯要高于紫外灯。

3小结与讨论

张天宇[4]研究表明,部分链格孢不同种间菌丝形态的差异小,只有在菌丝产生一些特殊结构时才有分类学上的鉴别价值;链格孢属不同种之间在菌落形态、生长速度等方面常有差别,菌落作为种级鉴别特征对个别种有参考价值。在本研究过程中,12种萝卜黑斑病菌在PDA培养基上培养20 d,可以较为明显地观察到菌丝的生长形态和变化,20 d后通过显微镜可以较为方便地统计链格孢的产孢数量, JZHB7菌株在12个菌株中产孢量最高。

肖长坤等[5]筛选出适合黑斑病菌生长的PDA、PSA和SNA 3种培养基,其中在PDA培养基上供试菌株生长速率均比较快,因此PDA培养基是一种适宜用来大量培养黑斑病菌菌丝体的培养基,这也与已有的相关报道结果一致;SNA培养基同样适宜培养,其具有一定的种间选择性和促进产孢的作用,适合用于病原菌分离、纯化和鉴定[6]。

对于链格孢的适宜培养基已有类似报道[7]。本研究发现链格孢JZHB7在多种培养基上能生长,不同的培养基上菌丝生长速率以及菌落形态有较大差异,其中,在豆芽培养基上生长最好,产孢量最大。

JZHB7菌株在0~35 ℃范围内孢子均可萌发;最适孢子萌发温度为15 ℃,此时萌发率最高;0 ℃时萌发率最低;15~35 ℃孢子萌发率随温度上升而降低。这与前人[8-11]的研究结果相似。

JZHB7菌株培养4~7 d生长较快, 10~13 d生长较慢。这与已有的研究结果[12]基本相符。

紫外灯照射不利于JZHB7产孢,日光灯照射2 h产孢最多, 24 h产孢最少。

参考文献:

[1] 郑建秋,胡荣娟,王艳梅,等.秋白菜黑斑病产量损失关键期分析[J].北京农业科学,1994,12(2):39-40.

[2] 吕佩珂,苏慧兰,高振江,等.中国现代蔬菜病虫原色图鉴[M]. 呼和浩特:远方出版社,2008.

[3] 李明远.萝卜链格孢形态学的研究[J].华北农业学报,1993,8(3):98-101.

[4] 张天字.中国真菌志第十六卷 链格孢属[M].北京:科学出版社,2003.

[5] 肖长坤,李勇,李健强.十字花科蔬菜种传黑斑病研究进展[J].中国农业大学学报,2003,8(5):61-68.

[6] 阎淑娟,董金皋,樊幕贞.白菜黑斑病菌营养生长与毒素产生关系的初步研究[J].河北农业大学学报,1998,21(1):23-26.

[7] 李多川,张天宇.链格孢属(丝孢纲)数值分类研究初探[J].真菌学报,1993,12(3):239-246.

[8] 蔡吉苗,李超萍,时涛,等.木薯炭疽病病原鉴定及其生物学特性研究[J].安徽农业科学,2010,38(10):5435-5438.

[9] 任小杰,梁艳,陆金萍,等.上海地区草莓炭疽病病原鉴定[J].植物病理学报,2008,38(3):325-328.

[10] 林清洪,林光荣,刘福平,等.鹤望兰炭疽病的生物学特性及杀菌剂的药效研究[J].福建农业学报,2006,21(3):13-20.

[11] 范晓龙,朱建华,周旭,等.南方红豆杉炭疽病病原鉴定及其生物学特性[J].福建林学院学报,2006,26(2):117-122.

[12] 肖长坤,吴学宏,李健强.白菜黑斑病菌三个种菌株基本培养条件比较[J].菌物学报,2004,23(4):573-579.

2.3温度对孢子萌发的影响

不同温度条件下JZHB7菌株的孢子萌发情况见图3。JZHB7菌株孢子在15 ℃时萌发率最高,在0 ℃时萌发率最低。在0~15 ℃随温度升高孢子萌发显著增多,在15~35 ℃随温度升高孢子萌发显著减少,说明高温抑制孢子的萌发,4个温度条件下孢子萌发率差异均显著(P<0.05,SPSS)。

2.4培养时间对菌丝生长的影响

在25 ℃时JZHB7菌落的生长状况见图4-图8。从图4可看出,JZHB7菌丝在4~7 d生长较快, 10~13 d生长较慢, 4个测量时间的菌落直径差异均显著(P<0.05,SPSS)。

2.5不同光照对产孢的影响

JZHB7菌株用豆芽培养基培养9 d后用40 W紫外灯及40 W日光灯分别照射1、2、8、24 h, 观察对产孢量的影响(图9)。JZHB7菌株在紫外灯照射下产孢量远低于日光灯,两者差异显著(P<0.05, SPSS)。日光灯照射2 h时产孢最多, 照射24 h产孢最少,但产孢量差异不显著(P>0.05, SPSS)。比较两种光源对黑斑病菌产孢的促进效能,显然日光灯要高于紫外灯。

3小结与讨论

张天宇[4]研究表明,部分链格孢不同种间菌丝形态的差异小,只有在菌丝产生一些特殊结构时才有分类学上的鉴别价值;链格孢属不同种之间在菌落形态、生长速度等方面常有差别,菌落作为种级鉴别特征对个别种有参考价值。在本研究过程中,12种萝卜黑斑病菌在PDA培养基上培养20 d,可以较为明显地观察到菌丝的生长形态和变化,20 d后通过显微镜可以较为方便地统计链格孢的产孢数量, JZHB7菌株在12个菌株中产孢量最高。

肖长坤等[5]筛选出适合黑斑病菌生长的PDA、PSA和SNA 3种培养基,其中在PDA培养基上供试菌株生长速率均比较快,因此PDA培养基是一种适宜用来大量培养黑斑病菌菌丝体的培养基,这也与已有的相关报道结果一致;SNA培养基同样适宜培养,其具有一定的种间选择性和促进产孢的作用,适合用于病原菌分离、纯化和鉴定[6]。

对于链格孢的适宜培养基已有类似报道[7]。本研究发现链格孢JZHB7在多种培养基上能生长,不同的培养基上菌丝生长速率以及菌落形态有较大差异,其中,在豆芽培养基上生长最好,产孢量最大。

JZHB7菌株在0~35 ℃范围内孢子均可萌发;最适孢子萌发温度为15 ℃,此时萌发率最高;0 ℃时萌发率最低;15~35 ℃孢子萌发率随温度上升而降低。这与前人[8-11]的研究结果相似。

JZHB7菌株培养4~7 d生长较快, 10~13 d生长较慢。这与已有的研究结果[12]基本相符。

紫外灯照射不利于JZHB7产孢,日光灯照射2 h产孢最多, 24 h产孢最少。

参考文献:

[1] 郑建秋,胡荣娟,王艳梅,等.秋白菜黑斑病产量损失关键期分析[J].北京农业科学,1994,12(2):39-40.

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[3] 李明远.萝卜链格孢形态学的研究[J].华北农业学报,1993,8(3):98-101.

[4] 张天字.中国真菌志第十六卷 链格孢属[M].北京:科学出版社,2003.

[5] 肖长坤,李勇,李健强.十字花科蔬菜种传黑斑病研究进展[J].中国农业大学学报,2003,8(5):61-68.

[6] 阎淑娟,董金皋,樊幕贞.白菜黑斑病菌营养生长与毒素产生关系的初步研究[J].河北农业大学学报,1998,21(1):23-26.

[7] 李多川,张天宇.链格孢属(丝孢纲)数值分类研究初探[J].真菌学报,1993,12(3):239-246.

[8] 蔡吉苗,李超萍,时涛,等.木薯炭疽病病原鉴定及其生物学特性研究[J].安徽农业科学,2010,38(10):5435-5438.

[9] 任小杰,梁艳,陆金萍,等.上海地区草莓炭疽病病原鉴定[J].植物病理学报,2008,38(3):325-328.

[10] 林清洪,林光荣,刘福平,等.鹤望兰炭疽病的生物学特性及杀菌剂的药效研究[J].福建农业学报,2006,21(3):13-20.

[11] 范晓龙,朱建华,周旭,等.南方红豆杉炭疽病病原鉴定及其生物学特性[J].福建林学院学报,2006,26(2):117-122.

[12] 肖长坤,吴学宏,李健强.白菜黑斑病菌三个种菌株基本培养条件比较[J].菌物学报,2004,23(4):573-579.