何世成，王昌建，邱立新，王卫国，唐小明，鲁杏华，林 源，范仲鑫，朱春霞，刘道新

（湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙410014）

高致病性禽流感（HPAI）是养禽业的头号杀手，也是具有重要公共卫生意义的人兽共患病［1－3］。目前，我国引起HPAI的病原主要为H5亚型禽流感病毒［1－2］。我国对HPAI的防控采取免疫与扑杀相结合的综合措施［3－4］，高免疫压力可使 HPAI流行毒株基因变异速度加快［5－7］。为确保免疫效果，我国农业部屡次更换HPAI疫苗种毒株，2012年6月，我国农业部在全国范围内将高致病性禽流感疫苗生产种毒Re－5株更换为Re－6株。为掌握重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re－6株）免疫鸭的临床效果，本试验选择市场上流通的6家企业生产的重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re－6株）对农村散养鸭进行了临床免疫效果研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 A、B、C、D、E、F等6个企业生产的重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re－6株），试验用疫苗随机取自湖南省县级疫苗储备库，且均在使用有效期内。

1.1.2 试验用动物及场地 汉寿县洋淘湖镇李发财蛋鸭场，该场场主具有10年以上蛋鸭饲养经验，场内有近20亩水面，有良好的饲养棚具和优良的防疫条件。试验用同批次鸭为1 000羽，试验期间不同群饲养其他鸭。

1.1.3 检测试剂 禽流感病毒 H5（Re－6）血凝抑制试验抗原（批号2013002）与阳性血清（批号2013001），哈尔滨维科生物技术开发公司产品；禽流感病毒H5亚型荧光RT－PCR检测试剂，中山大学达安基因股份有限公司产品（批号：2013001）。

1.2 方法

1.2.1 免疫试验 用6个厂家生产的疫苗同时进行25日龄鸭免疫试验。试验分7组，其中，6个试验组（以A、B、C、D、E、F为组别标识）分别用6个厂家生产的疫苗免疫，每组130羽，其余220羽为空白对照组（Blank），各试验组用塑料小标签作为脚标进行区别。免疫前，随机采集试验鸭血清、咽拭子和泄殖腔拭子各30份，疫苗组每羽颈后皮下注射对应厂家生产的疫苗0.5mL，空白对照组不免疫；从免疫接种后开始，连续7d，对试验鸭进行临床观察并记录；分别于免疫接种后14、22、29、48、77、105、133、165d进行采样，每组随机采集血清、咽拭子和泄殖腔拭子各20份。

1.2.2 实验室检测 应用 HA－HI试验［8］检测血清中的 H5AIV（Re－6）抗体，结果依据《2013年国家动物疫病监测与流行病学调查计划》（农医发［2013］9号）判断标准进行判断，即抗体效价≥4log2判定为抗体合格，抗体合格的样品数占同组样品总数的比率为合格率，合格率≥70%为群体免疫合格。应用禽流感病毒H5亚型荧光RT－PCR检测试剂盒检测咽拭子和泄殖腔拭子中的H5AIV核酸。

2 结果

2.1 临床反应情况

试验鸭免疫接种后连续观察7d，均未出现免疫接种副反应，精神状况良好，食欲及生长发育正常。

2.2 试验鸭血清中 H5AIV（Re－6）抗体检测结果

各组免疫接种前后血清 H5AIV（Re－6）HI抗体效价检测结果见表1和图1，合格率结果见表2和图2，变异系数统计结果见表3和图3、图4。结果显示，A组、B组、D组、E组、F组疫苗免疫接种后14d其平均抗体效价上升至合格效价标准（4log2）以上，并获得70%以上的群体合格率，其中，B组、E组、F组抗体有效持续期（平均抗体效价≥4log2、群体合格率≥70%）在151d以上，A组抗体有效持续期稍短，为119d，D组在免疫接种后105d平均抗体效价下降至4log2以下，其抗体有效持续期仅为63d；C组疫苗免疫接种后22d其平均抗体效价上升至合格效价标准以上，并获得70%以上的群体合格率，其有效持续时间达111d；6个试验组各时间点抗体效价变异系数为0.14～0.93，平均变异系数为0.26～0.44，效价整齐度高。对各试验组各时间点的平均抗体效价进行单因素方差分析，结果显示，6组疫苗免疫组与空白对照组差异极显著（P＜0.01）；D组与A组的免疫效果差异显著（P＜0.05），与B组、E组、F组差异极显著（P＜0.05）；C组与E组差异显著（P＜0.05），与F组差异极显著（P＜0.01）；F组与A组、B组差异显著（P＜0.05）；其余试验组间免疫效果差异不显著（P＞0.05）。

表1 H5AIV（Re－6）抗体效价检测结果Table 1 The detection results of antibody titer of H5AIV（Re－6）

表2 H5AIV（Re－6）抗体合格率结果Table 2 The results of qualified rate of H5AIV（Re－6）antibodies %

图1 H5AIV（Re－6）抗体效价曲线图Fig.1 The curve of H5AIV（Re－6）antibody titer

图2 H5AIV（Re－6）抗体合格率曲线图Fig.2 The curve of H5AIV（Re－6）antibody qualified rate

表3 H5AIV（Re－6）抗体效价变异系数Table 3 The variation coefficient of H5AIV（Re－6）antibody titers

图3 免疫接种后不同时间点H5AIV（Re－6）抗体效价变异系数图Fig.3 The variation coefficient of H5AIV（Re－6）antibody titers at different times

图4 各试验组 H5AIV（Re－6）抗体效价变异系数平均值柱形图Fig.4 The mean variation coefficient of H5AIV（Re－6）antibody titers in the experimental groups

2.3 试验动物拭子病原学检测结果

试验鸭免疫接种前后各时间点拭子样品经荧光RT－PCR检测，H5亚型AIV核酸均为阴性。

3 讨论

试验结果显示，重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re－6株）对农村散养鸭具有良好的临床安全性，可产生较好的免疫反应；不同企业生产的疫苗免疫效果存在差异，部分企业生产的疫苗之间差异显著，且部分差异极显著。

试验结果显示，重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re－6株）对农村散养鸭疫苗免疫接种后产生有效免疫保护（平均抗体效价≥4log2、群体合格率≥70%）的时间在免后14d～22d，免疫保护持续期最长达151d以上。

变异系数常用于反映试验数据离散程度。本次试验的6组疫苗，诱导的抗体效价平均变异系数均在0.44以下，最低的仅为0.26，表明试验疫苗的免疫效果受个体差异的影响很小，群体免疫的均一性良好。

禽流感灭活疫苗对水禽进行一次免疫接种的免疫效果历来较差，抗体水平较低，抗体合格持续期短［9－13］。本次试验所有试验疫苗均进行一次免疫接种，除1组疫苗免疫效果较差外，其他组疫苗的免疫效果，在抗体产生速度和合格抗体持续时间上，均明显优于以往报道，其原因可能是疫苗用种毒株Re－6株对鸭的免疫原性优于以往的疫苗毒株。

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