王秀阁，赵金祥，朴春丽，陈 曦，高林花

(长春中医药大学附属医院，长春 130021)

解毒通络保肾胶囊对糖尿病肾病大鼠肾组织中ColⅣ及FN表达的影响

王秀阁，赵金祥，朴春丽，陈 曦，高林花

(长春中医药大学附属医院，长春 130021)

目的 探讨解毒通络保肾胶囊对糖尿病肾病(DN)大鼠肾组织中Ⅳ型胶原(ColⅣ)及纤维连接蛋白(FN)表达的影响。方法 高脂饲料喂饲加腹腔注射链脲佐菌素复制DN大鼠模型，随机分为正常对照组、模型组、解毒通络保肾组、阳性对照组(罗格列酮联合贝那普利)。16周后采用免疫组化技术检测各组大鼠肾小球中ColⅣ及FN的表达水平，同时检测血糖、尿素氮、肌酐、尿微量白蛋白等指标的变化情况。结果 模型组大鼠血糖、尿素氮、肌酐、尿微量白蛋白、ColⅣ及FN的表达明显升高(P＜0.01)，与模型组相比，解毒通络保肾组大鼠血糖、尿素氮、肌酐、尿微量白蛋白、ColⅣ及FN的表达均明显降低(P＜0.01)。结论 解毒通络保肾胶囊能够减少肾组织中ColⅣ、FN含量，抑制肾小球ECM积聚，延缓DN的进展。

解毒通络保肾胶囊;糖尿病肾病;Ⅳ型胶原(ColⅣ);纤维连接蛋白

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病慢性并发症，属于糖尿病微血管病变，是糖尿病患者死亡的重要原因之一。中医药治疗DN取得了较好的临床疗效，并具有其独特优势，在改善临床症状、降低各项生化指标、保护肾脏以及控制病情发展方面均起到重要作用，尤其在降尿蛋白方面，疗效显著［1］。本研究通过免疫组化实验，对实验性DN大鼠肾脏组织中ColⅣ和FN蛋白的沉积情况进行观察，并以解毒通络保肾胶囊进行干预，以探讨解毒通络保肾胶囊治疗DN的疗效及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型的复制 Wistar大鼠，雄性，110只，按体质量随机分正常组10只，造模组100只。造模组大鼠给予高脂饲料，正常组大鼠给予普通饲料，连续喂养4周。4周后造模组大鼠一次性腹腔注射链尿佐菌素30 mg/kg，正常组大鼠腹腔注射等体积缓冲液。72 h后，造模组大鼠检测空腹血糖(尾静脉采血)及尿糖(尿糖试纸测)，以空腹血糖≥16.7 mmol/L，尿糖+++以上为标准，达到该标准的大鼠列为观察对象。

1.2 实验动物分组及给药方法 造模成功的大鼠根据体质量及空腹血糖情况，随机分为模型组、解毒通络组、保肾组、解毒通络保肾组、罗格列酮合用贝那普利组(阳性对照组)，每组15只。解毒通络保肾组按1.4 g/kg体质量给予解毒通络保肾胶囊混悬液灌胃(1.5 mL/100 g体质量)，解毒通络组按1.4 g/kg体质量给予解毒通络胶囊混悬液灌胃(1.5 mL/100 g体质量)，保肾组按1.4 g/kg体质量给予保肾胶囊混悬液灌胃(1.5 mL/100 g体质量)，阳性对照组按0.8 mg/kg体质量给予罗格列酮及2 mg/kg体质量给予贝那普利混悬液灌胃，正常对照组及模型组给予等体积蒸馏水灌胃，每日上午9时灌胃，连续灌胃12周。

1.3 主要试剂及药品 链脲佐菌素:美国Sigma公司;兔抗大鼠ColⅣ多克隆抗体、兔抗大鼠FN多克隆抗体:北京博奥森生物技术有限公司;解毒通络保肾胶囊:吉林省七星山药业有限公司(J中药字2009-1234号);解毒通络胶囊、保肾胶囊均由吉林省七星山药业有限公司协助制作;马来酸罗格列酮片:天津葛兰素史克公司(批号:H20020475);盐酸贝那普利片:北京诺华制药有限公司(批号:H20030514)。

1.4 标本采集及指标检测 实验期间，每2周检测1次空腹尾静脉血糖，每2周收集1次尿液测定尿微量白蛋白。实验16周末，眶后静脉取血备测生化指标。打开腹腔，切取一小块肾皮质，固定于10%中性福尔马林液中，免疫组化法检测ColⅣ及FN。

1.4.1 生化指标检测 Accu-chek Advantage血糖仪检测血糖;日立7150型生化自动分析仪检测血清尿素氮、血清肌酐含量。

1.4.2 尿微量白蛋白检测 采用ELISA法检测，按照试剂盒说明书操作。

1.4.3 免疫组化检测 测定ColⅣ及FN。

1.5 统计学处理 统计分析采用SPSS 19.0软件，数据以均数±标准差(±s)表示。以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血糖、肾功能等指标变化比较 见表1。

表1 各组大鼠16周末空腹血糖、BUN、Scr含量变化比较(±s，n=15)

表1 各组大鼠16周末空腹血糖、BUN、Scr含量变化比较(±s，n=15)

注:与正常对照组比较，##P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.01;与解毒通络保肾组比较，▲P＜0.05

组 别 空腹血糖/(mmol/L)BUN/(mmol/L)Scr/(μmol/L)正常对照组 4.78 ±0.49 7.34±0.79 72.90±5.21模型组 23.89 ±2.31## 21.29±1.01## 111.11±9.91##保肾组 9.52±1.35##△△ 15.68±0.95##△△▲ 97.87±3.26##△△▲解毒通络组 9.12±1.13##△△ 15.35±1.23##△△▲ 96.43±5.37##△△▲解毒通络保肾组 8.84±1.05##△△ 11.17±0.97##△△ 90.27±4.84##△△阳性对照组 9.51±1.30##△△ 12.52±0.97##△△▲ 93.80±6.89##△△▲

2.2 各组大鼠尿微量白蛋白动态变化比较 见表2。

表2 各组大鼠8，12，16周末尿微量白蛋白变化比较(±s，n=15)μg/mL

表2 各组大鼠8，12，16周末尿微量白蛋白变化比较(±s，n=15)μg/mL

注:与正常对照组比较，##P＜0.01;与模型组比较，△△P＜0.01

组 别 8周 12周 16周正常对照组 7.71 ±0.40 9.56±0.58 11.39±0.65模型组 13.40 ±1.65## 18.11±2.43## 21.36±3.14##保肾组 10.37±1.27##△△ 12.95±1.37##△△ 16.01±1.64##△△解毒通络组 10.53±1.31##△△ 12.87±1.28##△△ 15.78±1.59##△△解毒通络保肾组 10.22±1.29##△△ 12.64±1.42##△△ 15.20±1.76##△△阳性对照组 9.87±1.27##△△ 12.26±1.15##△△ 14.74±1.71##△△

2.3 各组大鼠肾组织ColⅣ、FN免疫组织化学检测结果 见表3。

表3 各组大鼠16周末肾组织ColⅣ、FN蛋白表达半定量结果(±s，n=15)

表3 各组大鼠16周末肾组织ColⅣ、FN蛋白表达半定量结果(±s，n=15)

注:与正常对照组比较，##P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.05;与解毒通络保肾组比较，▲▲P＜0.01

组 别 ColⅣFN正常对照组 6.10 ±1.20 5.50 ±1.08模型组 24.44 ±1.42## 31.33 ±1.73##保肾组 16.48 ±1.43##△ 16.57±1.41##△▲▲解毒通络组 15.75±1.32##△ 14.87±1.26##△▲▲解毒通络保肾组 15.18±0.98##△ 7.63±0.67##△阳性对照组 15.90±1.59##△ 15.50±1.27##△▲▲

3 小结

解毒通络保肾胶囊由榛花、大黄、黄芪、生地黄、黄连、枸杞子、丹参、地龙、金银花等药物组成，方中榛花、大黄共为君药，重在解毒化瘀;黄连、金银花清热解毒、燥湿祛浊，黄芪、丹参益气通络、扶正抗毒，4药共为臣药，可起到助君药增强解毒的作用;生地黄、枸杞子养阴生津、滋补肝肾，共为佐药;地龙作为使药，可走窜入络。诸药合用，共奏解毒通络、保肾化瘀之功效。全方调和脏腑阴阳、平衡气血、攻补兼施、扶正祛邪、使瘀浊祛，肾络通，元气旺，毒解肾安。

本研究结果表明，模型组大鼠肾小球内ColⅣ、FN的表达明显升高，提示ColⅣ、FN能够促进ECM的积聚，导致肾小球硬化及肾间质纤维化，在DN中发挥重要作用［2-5］。经解毒通络保肾胶囊干预后，大鼠肾小球内表达的ColⅣ、FN明显低于模型组，同时，经解毒通络保肾胶囊干预后的大鼠血糖、肾功能、尿微量白蛋白均较模型组明显改善，提示解毒通络保肾胶囊可能通过减少肾组织中ColⅣ、FN含量，抑制肾小球ECM积聚，延缓DN的进展。

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［1］周静波.糖尿病肾病蛋白尿的中医药治疗研究［J］.长春中医药大学学报，2012，28(2):261-263.

［2］Levey A S，Coresh J，Balk E，et al.National Kidney Foundation practice guidelines for chronic kidney disease:evaluation，classification，and stratification［J］.Annals of internal medicine，2003，139(2):137-147.

［3］Dalla Vestra M，Saller A，Bortoloso E，et al.Structural involvement in type 1 and type 2 diabetic nephropathy［J］.Diabetes＆ metabolism，2000，26:8-14.

［4］Aumailley M.Structure and supramolecular organization of basement membranes［J］.Kidney international.Supplement，1995，49:4.

［5］刘楠梅.基质金属蛋白酶-2与糖尿病肾病［J］.中华实用医学，2003，5(16):72-74.

Influence of expression of ColⅣand FN in renal tissue intervened byJieDu TongLuo BaoShen Capsuleon diabetic nephropathy rat

WANG Xiuge，ZHAO Jinxiang，PIAO Chunli，CHEN Xi，GAO Linhua
(Changchun University of Chinese Medicine Affiliated Hospital，Changchun 130021，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of expression ofⅣ collagen(ColⅣ)and fibronectin(FN)in renal tissue intervened byJieDu TongLuo BaoShen Capsuleon diabetic nephropathy rat.MethodsDiabetic nephropathy model in rats were duplicated by hyper-lipoid raised and STZ-injected.All rats were randomly divided into normal control group，model group，JieDu TongLuo BaoShen Capsulegroup，positive control group(rosiglitazone combined with benazepril).After 16 weeks，the expression level of ColⅣ and FN in glomerular were detected by immunohistochemical method.At the same time，the change of blood glucose，blood urea nitrogen，creatinine and urinary microalbumin were detected.ResultsThe expression of blood sugar，blood urea nitrogen，serum creatinine，urine microalbumin，ColⅣ and FN were markedly elevated in model group(P＜0.01).Compared with the model group，the expression of blood sugar，blood urea nitrogen，serum creatinine，urine microalbumin，ColⅣ and FN were significantly lower inJieDu TongLuo BaoShengroup(P＜0.01).ConclusionJieDu TongLuo BaoShen Capsulecan reduce the contents of ColⅣ and FN in renal tissue，inhibit the accumulation of ECM in glomerular，deloy the progress of diabetic nephropathy.

Key words:JieDu TongLuo BaoShen Capsule;diabetic nephropathy;CollagenⅣ;fibronectin

R285.5

A

2095－6258(2014)04－0598－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.04.013

吉林省科技厅自然科学基金项目(201015208)。

王秀阁(1966－)，女，教授，硕士研究生导师。研究方向:中医药治疗内分泌疾病及其机制研究。

(

2014－03－28)