林丽敏，赵云，2，彭璐，王艳阳，盖雅婷，金鑫，2Δ

（1.厦门大学 医学院，福建 厦门 361102；2.厦门市手性药物重点实验室，福建 厦门 361102）

积雪草酸对高脂血症金黄地鼠的血脂调节及肝脏保护作用研究

林丽敏1，赵云1，2，彭璐1，王艳阳1，盖雅婷1，金鑫1，2Δ

（1.厦门大学 医学院，福建 厦门 361102；2.厦门市手性药物重点实验室，福建 厦门 361102）

目的研究积雪草酸（asiatic acid，AA）对饮食性高脂血症金黄地鼠的血脂调节和肝脏保护作用，探讨其降脂机制。方法将48只叙利亚金黄地鼠随机分为6组，分别为正常对照组、高脂血症模型组、阳性对照药血脂康组（250mg／kg）、AA低剂量组（8mg／kg）、AA中剂量组（16mg／kg）和AA高剂量组（32mg／kg）。正常组给予普通饲料，其余各组均给予高脂饲料造模，自由进食和饮水。同时灌胃给药，正常组和模型组按体重给予溶媒（Tween 80∶去离子水＝1∶19），其余各组给予相应受试药物。4周后测定血清总胆固醇（total cholestrol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein）、谷草转氨酶（aspartate transaminase）和谷丙转氨酶（alanine aminotransferase）水平，肝脏超氧化物歧化酶（superoxide dismutase）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase）水平以及观察肝脏结构变化。同时采用实时荧光定量PCR方法考察肝脏中卵磷脂胆固醇酰基转移酶（lecithin cholesterol fatty acyl transferase）和B类Ⅰ型清道夫受体（class B typeⅠscavenger receptor）mRNA的表达。结果与模型组相比，除AA高剂量组外，其余各给药组TC、TG、LDL-C、TC／HDL、AST、ALT水平均显著降低，SOD活性及GSH-Px水平均显著升高（P＜0.01）。HE染色结果显示AA给药后抑制了高脂血症金黄地鼠的肝脏脂肪性病变。荧光定量PCR结果显示AA各给药组金黄地鼠肝脏中LCAT和SR-BⅠmRNA表达水平增加。结论AA可有效调节血脂，并通过降低AST、ALT水平和抗氧化作用减轻高脂血症金黄地鼠的肝脏损伤。AA的降血脂机制及保护肝脏作用，可能与其增强LCAT和SR-BⅠmRNA的表达有关。

积雪草酸；高脂血症；金黄地鼠

心脑血管疾病是威胁人类健康的头号杀手，高血脂是导致 心脑血管疾病的重要原因，它会诱发冠心病［1］、脂肪肝［2］、动脉粥样硬化、糖尿病［3］、肥胖等疾病。随着人民收入水平的增加和饮食结构的改变，摄取的高蛋白、高脂肪及高糖分食物越来越多，使高脂血症的发病率有逐年上升的趋势，而且其发病年龄也有所提前。因此，控制血脂的升高，预防高脂血症，开发安全有效的调血脂药物对人类健康有着十分重要的意义。

积雪草是我国传统的药用植物，为伞形科积雪草属植物积雪草（Centella asiatica L.Urban）的干燥全草。性微凉，味微苦、甘。有清热解毒，散瘀止痛、凉血生津、利尿的功效，被称为东方人的长寿药。积雪草酸是积雪草中含量较高的乌苏烷型五环三萜酸［4］。据报道，积雪草酸具有抗炎、促进伤口愈合的作用［5］，同时能够改善记忆［6］、抗氧化应激［7］及阻断肝脏的纤维化［8］。本实验通过建立金黄地鼠饮食性高脂血症模型，给予不同浓度积雪草酸干预，来探讨积雪草酸的降血脂及肝脏保护作用，为寻找新的调脂药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Syrian金黄地鼠，雄性，体质量85～95 g［上海市松江区松联实验动物场，许可证号：SCXK（沪）2007-0011］。实验前，动物适应性饲养1 w，自由饮水，给予正常饲料，光照及暗夜环境各为12 h，室内温度为22℃～25℃，湿度：40%～60%。

1.2 药品和试剂 积雪草酸（广西昌洲天然药业有限公司，批号：121060），白色粉末，纯度为95%，；血脂康胶囊（北大维信生物科技有限公司，批号：20130310）；Tween 80，化学纯（西陇化工股份有限公司）；胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）测定试剂盒（北京北化康泰试剂有限公司）；考马斯亮蓝、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。Trizol（美国Invitrogen公司）；反转录试剂盒（Thermo公司）；相关引物 、SYBR Green PCR混合液 （Takara公司）。

1.3 主要仪器 2-16K台式高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；SpectraMax-M2多功能酶标仪（美国分子仪器公司）；CM 1850 UV冰冻切片机（德国莱卡公司）；ECLIPSE 50I倒置显微镜（日本尼康公司）；Biospectrmeter（德国 Eppendorf公司）；7300荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1.4 模型制备与动物分组 本研究符合厦门大学实验动物伦理委员会批准。动物于实验前适应性饲养1w。将金黄地鼠随机分成6组：空白对照组（Control），模型组（Model），血脂康阳性对照药组（Xzk）以及积雪草酸低剂量组（AA-L），积雪草酸中剂量组（AA-M），积雪草酸高剂量组（AA-H），每组8只。空白对照组给予普通饲料，其余各组均给予高脂饲料造模。高脂饲料配方为：2%胆固醇、10%猪油、88%基础饲料。同时，AA-L组、AA-M组、AA-H组分别灌胃给予 AA溶液（8、16、32 mg／kg），阳性对照组给予Xzk溶液（250mg／kg），空白对照组和模型组给予溶煤（Tween 80∶去离子水1∶19）。给药至第4w末，心脏取血，取出肝脏，用生理盐水漂洗滤纸吸干水分后马上称重记录，迅速取相应部位肝脏制成冰冻切片，观察肝组织脂肪沉积情况。剩余肝脏组织于 －80℃保存备用，血液于4℃ 3000 r／min离心10min后取上清备用，以测定血清及肝组织相关生化指标。

1.5 血清生化指标和肝脏系数测定 血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST测定按试剂盒说明书进行，在酶标仪上测定。肝脏系数 ＝肝重（g）／鼠重（100 g）。

1.6 肝脏组织中SOD、GSH-PX水平测定 每只动物称取相应部位肝组织300mg，加预冷生理盐水2.7mL匀浆，离心取上清液，分别按试剂盒说明在酶标仪上测定其蛋白浓度、SOD和GSH-PX浓度。

1.7 组织学观察 迅速取每只金黄地鼠肝脏相应部位制作冰冻切片，切片厚度为6 um，HE染色后于100倍光镜下观察。

1.8 实时荧光定量PCR检测肝脏中脂质相关基因的表达

称取约100 mg的肝脏组织提取总RNA，测定RNA浓度及A260／A280，随后按逆转录试剂盒方法合成cDNA，置于－20℃保存备用，用SYBR GreenⅡ染料进行荧光定量PCR，检测LCAT、SRBⅠmRNA表达水平。实验重复3次，反应条件为：95℃ 30 s进行预变性，然后两步法进行扩增，95℃5 s→60℃31 s，40个循环。将各组样本的Ct值通过与其内参基因GAPDH的Ct值进行处理计算出 2－ΔΔCt。改变的倍数 ＝2－ΔΔCt＝（CT靶基因 －CT内参）处理组－（CT靶基因 －CT内参）未处理组［9］。引物序列如下：LCAT：5’-TGGATGTGCTACCGTAAGACA-3’ （sense），5’-TGTGGTTGTAGACAATCCTGGT-3’（antisense）［10］；SR-BⅠ：5’-TTTGGAGTGGTAGTAAAAAGGGC-3’（sense），5’-TGACATCAGGGACTCAGAGTAG-3’（antisense）［11］；GAPDH ：5’-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3’（sense），5’-GGAGATGATGA-CCCTTTTGGC-3’（antisense）［11］。

1.9 统计学方法 采用 Graphpad Prism 5（GraphPad Software Inc，USA）软件进行分析，正态计量数据用“±s”表示，两组间样本均数比较采用t检验。Real-time PCR数据采用2－ΔΔCt法处理。以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 积雪草酸对高脂血症金黄地鼠体质量、肝重及肝脏系数的影响 与正常对照组对比，模型组金黄地鼠体质量、肝重和肝脏系数均明显升高（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001）。连续给药4 w后，Xzk及AA-L组、AA-M组金黄地鼠体质量显著降低（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01），AA-H组金黄地鼠体质量有降低但与模型组比较没有统计学差异。Xzk、AA-L、AA-M均可显著减轻肝重（P＜0.001），AA-H组能降低肝重但变化不明显。AAL、AA-M给药组均能减少高脂血症金黄地鼠的肝脏系数（P＜0.001），Xzk和AA-H组没有明显变化（见表1）。

表1 积雪草酸对高脂血症金黄地鼠体质量、肝重和肝脏系数的影响Tab.1 Effect of asiatic acid on body weight，hepatic weight and coefficient of hepatic weight in hyperlipidemic golden hamster

2.2 积雪草酸对高脂血症金黄地鼠血脂代谢的影响 与正常对照组相比较，模型组金黄地鼠血清TC、TG和LDL水平均明显升高（P＜0.001），表明金黄地鼠高脂血症模型造模成功。连续给药4w后，阳性对照药Xzk、AA-L组、AA-M组、AA-H组均能明显降低高脂血症金黄地鼠血清TC、TG、LDL-C及TC／HDL-C的水平（P＜0.001，见图1）。

图1 积雪草酸对高脂血症金黄地鼠血清血脂水平的影响***P＜0.001，与模型组比较Fig.1 Effect of asiatic acid on serum lipid profile of hyperlipidemic golden hamsters***P＜0.001，compared with model group

2.3 积雪草酸对高脂血症金黄地鼠肝功能相关指标的影响 与正常对照组比较，模型组金黄地鼠血清AST、ALT水平均明显升高（P＜0.001）。连续给药4w后，阳性对照药Xzk和AAL组、AA-M组、AA-H组均能明显降低高脂血症金黄地鼠血清中AST、ALT水平（P＜0.01，P＜0.001，见图2）。

图2 积雪草酸对高脂血症金黄地鼠 ALT、AST活力的影响**P＜0.01，***P＜0.001，与模型组比较Fig.2 Effect of asiatic acid on serum ALT and AST of hyperlipidemic golden hamsters**P＜0.01，***P＜0.001，compared with model group

2.4 积雪草酸对高脂血症金黄地鼠肝组织中SOD和GSHPX水平的影响 与正常对照组相比，在模型组金黄地鼠中，与氧自由基及过氧化物清除相关的酶SOD、GSH-PX水平均明显降低（P＜0.001，P＜0.05）。连续给药4w后，阳性对照药Xzk能明显升高肝脏SOD活力（P＜0.001），及肝脏GSH-PX水平（P＜0.01）。AA-L组、AA-M组、AA-H组均能明显升高高脂血症金黄地鼠肝组织SOD活力（P＜0.001）及GSH-PX水平（P＜0.001，见图3）。

图3 积雪草酸对高脂血症金黄地鼠SOD、GSH-PX水平的影响*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与模型组比较Fig.3 Effect of asiatic acid on hepatic SOD and GSH-PX levels ofhyperlipidemic golden hamsters*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，compared with model group

2.5 组织学观察 肉眼观察正常对照组金黄地鼠肝脏呈红褐色、色泽鲜亮；模型组肝脏呈灰白色、无光泽、体积明显增大；Xzk组肝组织颜色呈淡红色偏黄，体积较对照组增大；AA各浓度给药组肝组织颜色较空白对照组颜色白，光泽度较差，体积较模型组减小。肝脏冰冻切片HE染色结果表明：空白对照组肝小叶结构完整、脂质空泡少；模型组肝细胞内可见大量脂质空泡，肝细胞排列紊乱；Xzk及AA各浓度给药组脂质空泡较模型组明显减少，细胞排列相对整齐（见图4）。

图4 金黄地鼠肝脏冰冻切片HE染色结果（×100）Fig.4 Histological examination detected by HE staining of golden hamsters liver frozen slices（×100）

2.6 积雪草酸对高脂血症金黄地鼠肝脏组织中LCAT和SR-BⅠmRNA表达的影响 与正常对照组相比，模型组肝脏中LCATmRNA表达水平明显降低（P＜0.05），AA-L组、AA-M组和模型组相比，金黄地鼠肝脏中LCATmRNA表达水平均有显著性的升高（P＜0.01），AA-H组LCAT mRNA表达水平有轻微的升高。与正常组比较，模型组肝脏中SR-BImRNA表达水平有所降低，AA-L组、AA-M组、AA-L组和模型组相比，肝脏中SR-BI mRNA表达水平均有不同程度的升高（见图5）。

图5 积雪草酸对高脂血症金黄地鼠肝脏LCAT和SR-BⅠmRNA表达的影响；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与模型组比较Fig.5 Effect of asiatic acid on hepatic mRNA expressions of LCAT and SR-BI in hyperlipidemic golden hamsters*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，compared withmodel group

3 讨论

与大鼠、小鼠、家兔、基因缺陷型动物等高脂血症动物模型相比，金黄地鼠的脂质代谢特征与人类更为相似［12-13］。而且金黄地鼠具有血量充足、容易饲养、对胆固醇耐受好、模型稳定等优势［14］，因此目前被普遍用于高脂血症［15］及动脉粥样硬化［16］的研究。综合以上因素，本研究采用金黄地鼠作为试验动物。

本次研究结果显示经高脂饲料喂养4 w后，模型组金黄地鼠TC、TG、LDL等血脂水平显著升高，表明高脂血症模型建立成功。给予不同浓度的积雪草酸干预后，血清TC、TG水平均有显著性下降，说明积雪草酸有调节高脂血症金黄地鼠血脂水平的作用。血清LDL-C水平的升高是唯一不需要其他因素协同作用而足以导致和促进动脉粥样硬化发生发展的独立危险因素［17］，分别给予血脂康及积雪草酸干预后，血清LDL-C水平明显降低，说明积雪草酸可能具有防治动脉粥样硬化的潜力。TC／HDL-C的高低反映了心脑血管疾病发病风险的高低，其比值越高表明发病的风险越高［18］。实验结果显示积雪草酸不同浓度给药后血清TC／HDL-C较模型组显著性降低，说明积雪草酸有保护心脑血管的作用。

ALT与AST主要分布在肝脏的肝细胞内。肝细胞坏死时血清ALT和AST就会升高，其升高的程度与肝细胞受损的程度相一致，因此是目前最常用的肝功能指标。ALT主要存在于肝细胞浆内，其细胞内浓度高于血清中1000～3000倍。只要有1%的肝细胞坏死，就可以使血清酶增高一倍。因此，ALT被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。从实验结果中看出积雪草酸可降低高脂血症金黄地鼠血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平，表明积雪草酸对金黄地鼠的肝损伤有一定的保护作用。

SOD可清除人体内过多的有害的氧自由基，具有调节血脂的保健作用，可预防动脉粥样硬化，预防高血脂引起的心脑血管疾病，降低脂质过氧化物的含量。谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。实验结果显示积雪草酸能够升高肝脏超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平，提示积雪草酸能提高肝脏自由基清除酶的活性，抵抗自由基介导的脂质过氧化，从而保护肝脏组织。

LCAT是催化胆固醇脂合成的关键酶［19］，能促进HDL对胆固醇的逆向转运作用，从而促进胆固醇的肝脏代谢；长期摄入高脂饮食会引起LCAT活性的降低，在本研究中，高脂血症模型组金黄地鼠肝脏组织中LCATmRNA表达出现明显降低。SR-BⅠ是第一个被明确的HDL受体，能介导细胞选择性摄取脂蛋白胆固醇酯，还促进细胞内游离胆固醇的流出，防止游离胆固醇在动脉壁中堆积，从而调节血清中胆固醇水平［20］；同时肝脏组织中SR-BⅠ的活性也起着调控胆固醇逆向转运过程的作用。本研究结果表明：积雪草酸可以增加LCAT和SR-BⅠ的mRNA表达，由此推测积雪草酸的调脂作用可能是通过调节LCAT和SR-BⅠ的表达来实现的。

综上所述，积雪草酸具有降血脂及保护肝脏的作用。积雪草酸对高脂血症金黄地鼠的肝脏保护作用体现在积雪草酸不仅降低了金黄地鼠血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶等与肝脏损伤相关的酶的酶活性，而且还提高了肝脏超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平。积雪草酸的降血脂作用机制可能是通过提高LCAT和SR-BⅠmRNA的表达来实现的，本研究结果为降血脂新药的进一步研究与开发奠定了基础。

［1］ Anum EA，Adera T.Hypercholesterolemia and coronary heart disease in the elderly：A meta-analysis［J］.Annals of Epidemiology，2004，14（9）：705-721.

［2］ Sengwayo D，Moraba M，Motaung S.Association of homocysteinaemia with hyperglycaemia，dyslipidaemia，hypertension and obesity［J］.Cardiovascular Journal of Africa，2013，24（7）：265-269.

［3］ Rector RS，Thyfault JP，Wei YZ，et al.Non-alcoholic fatty liver disease and the metabolic syndrome：An update［J］.World Journal of Gastroenterology，2008，14（2）：185-192.

［4］ 陈军，华维一，孙宏斌.积雪草酸及其衍生物的生物活性研究概况［J］.中草药，2006，37（3）：458-460.

［5］ Huang SS，Chiu CS，Chen HJ，et al.Antinociceptive activities and the mechanisms of anti-inflammation of asiatic acid inmice［J］.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2011，（8）：1-10.

［6］ Orhan IE.Centella asiatica（L.）Urban：from traditional medicine to modern medicine with neuroprotective potential［J］.Evidence-Based8 Complementary and Alternative Medicine，2012（3）：1-8.

［7］ Kumar MHV，Gupta YK.Effect of different extracts of Centella asiatica on cognition and markers of oxidative stress in rats［J］.Journal of Ethnopharmacology，2002，79（2）：253-260.

［8］ 杨光，谭家驹，何瑞华，等.积雪草酸阻断大鼠肝纤维化的实验研究［J］.中国中医基础医学杂志，2009，15（7）：540-542.

［9］ 纪冬，辛绍杰.实时荧光定量PCR的发展和数据分析［J］.生物技术通讯，2009（4）：598-600.

［10］ 刘泉，刘率男，李林忆，等.泊洛沙姆407诱发金黄地鼠脂质代谢紊乱模型及初步机制［J］.药学学报，2011，46（4）：406-411.

［11］ Yang DJ，Chang YY，Hsu CLi，etal.Protective effectof a litchi（Litchi chinensis Sonn.）-flower-water-extract on cardiovascular health in a high-fat／cholesterol-dietary hamsters［J］.Food Chemistry，2010（119）：1457-1464.

［12］ KrisEtherton PM，Dietschy J.Design criteria for studies examining individual fatty acid effects on cardiovascular disease risk factors：Human and animal studies［J］.American Journal of Clinical Nutrition，1997，65（5）：S1590-S1596.

［13］ Zhang LH，Perdomo G，Kim DH，et al.Proteomic analysis of fructoseinduced fatty liver in hamsters［J］.Metabolism-Clinical and Experimental，2008，57（8）：1115-1124.

［14］ 郭金英，李华，谢人明.金黄地鼠高血脂模型的建立［J］.中国实验动物学报，2007，15（1）：5-7.

［15］ ChoiWH，Gwon SY，Ahn J，et al.Cooked rice prevents hyperlipidemia in hamsters fed a high-fat／cholesterol diet by the regulation of the expression of hepatic genes involved in lipid metabolism［J］.Nutrition Research，2013，33（7）：572-579.

［16］ Guo T，Chen WQ，Zhang C，et al.Chymase activity is closely related with plaque vulnerability in a hamster model of atherosclerosis［J］.Atherosclerosis，2009，207（1）：59-67.

［17］ 杨永宗，阮长耿，唐朝枢，等.动脉粥样硬化性心血管病基础与临床［M］.北京：科学出版社，2004：11.

［18］ Srivastava RAK，He S.Anti-hyperlipidemic and insulin sensitizing activities of fenofibrate reduces aortic lipid deposition in hyperlipidemic Golden Syrian hamster［J］.Molecular and Cellular Biochemistry，2010，345（1-2）：197-206.

［19］ Calabresi L，Simonelli S，Gomaraschi M，et al.Genetic lecithin：cholesterol acyltransferase deficiency and cardiovascular disease［J］.Atherosclerosis，2012，222（2）：299-306.

［20］ Kozarsky KF，Donahee MH，RigottiA，etal.Overexpression of the HDL receptor SR-BI alters plasma HDL and bile cholesterol levels［J］.Nature，1997，387（6631）：414-417.

（编校：吴茜）

The hypolipidem ic and liver protective effect of asiatic acid on hyperlipidem ic golden hamsters

LIN Li-min1，ZHAO Yun1，2，PENG Lu1，WANG Yan-yang1，GAIYa-ting1，JIN-Xin1，2Δ

（1.Medical college，Xiamen University，Xiamen 361102，China；2.Xiamen Municipal Key laboratory of Chiral Drugs，Xiamen 361102，China）

ObjectiveTo observe the protective effect of asiatic acid on hyperlipidemia golden hamsters induced by high fat diet and explore its mechanism.MethodsHyperlipidemic golden hamsters fed with high-fat diet were administered orally with asiatic acid（8，16，32 mg／kg）for 4 weeks.Levels of serum lipid content，liver histology，hepatic GSH-PX and SOD levels，serum ALT and AST activities were evaluated in golden hamsters，fluorescence quantitative polymerase chain reaction（RT-PCR）is using to examine the liver lecithin cholesterol fatty acyl transferase（LCAT）and class B typeⅠscavenger receptor（SR-BⅠ）mRNA expression.ResultsCompared withmodel group，the levels of TC，TG，LDL-C，TC／HDL，ALT and AST in low and mediate asiatic acid groups were all significantly decreased but the levels of SOD and GSH-PX were significantly increased（P＜0.01）.HE staining results showed that fat deposition in the liverwere improved by administration of asiatic acid，and the expression of LCAT and SR-BⅠmRNA were increased.ConclusionAsiatic acid can effectively reduce blood lipid levels，and alleviate liver damage of the hyperlipidemia golden hamsters by lipid regulation and antioxidative ability augmentation.The increased levels of LCAT and SR-BⅠmRNA expression maybe involved in the mechanism of hypolipidaemic effect of asiatic acid.

asiatic acid；hyperlipidemia；golden hamster

R965

A

1005－1678（2014）04－0040－05

厦门市科技计划资助项目（3502Z20090009）；海峡（厦门）中医药科技平台项目（3502Z20100006）

林丽敏，硕士，研究方向：心血管药理学，E-mail：lin_limin＠sina.cn；金鑫，通信作者，博士，教授，研究方向：心血管药理学，E-mail：xinjin＠xmu.edu.cn。