姜 飚 靳 猛 张 伟 李 强

(1济宁医学院附属医院，山东 济宁 272029 2天津医科大学附属肿瘤医院，天津 300070)

胃癌(gastric carcinoma，GC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一。目前，GC研究的主要方向是寻找GC可能的致癌基因和促进转移的基因。高迁移率族蛋白B1 (High-mobility group box 1，HMGBl)在多种恶性肿瘤中呈现高表达，且与肿瘤的恶性程度及预后关系密切[1]。本文应用免疫组织化学、反转录PCR、Westem-blot的方法检测其在GC组织的表达及其与GC临床病理因素之间的关系。

1 资料与方法

1.1 临床病理资料

选取天津医科大学附属肿瘤医院胃部肿瘤科2011年1月1日至2011年10月30日手术切除的112例GC组织及配对的癌旁组织，其中男62例，女50例。年龄45～75岁，平均年龄60岁。乳头状腺癌10例，管状腺癌58例，黏液腺癌20例，印戒细胞癌21例，未分化癌3例。其中管状腺癌按WHO 2010年组织学标准分级分为高分化17例，中分化28例，低分化13例。按UICC 2010年新修订的TNM分期标准判定，Ⅰ期25例、Ⅱ期29例、Ⅲ期42例和Ⅳ期16例。有淋巴结转移的52例，无淋巴结转移的60例。所有癌旁组织距离原发癌组织边缘大于5cm。另外收集正常胃组织标本20例作为对照。

1.2 主要试剂

鼠抗人GAPDH多克隆抗体、HMGB1、GAPGH引物由湖南远泰生物科技公司提供；兔抗人HMGB1多克隆抗体和ECL Western-blotting 试剂盒分别购自美国Abeam公司和 Pierce 公司。DNA Marker购自日本 Takara 公司

1.3 方法

1.3.1免疫组织化学法染色(SABC法染色) 4%的多聚甲酸固定标本，滴加一抗HMGB1(1∶250)过夜，阴性对照用PBS代替一抗；滴加生物素标记的二抗，DAB染色，苏木素复染；光镜下观察染色结果，出现棕褐色颗粒为阳性表现。两位病理科医师独立阅片，每片均显微镜下随机取 10个400倍视野，每视野均计数 100 个细胞，计算细胞的阳性率。HMGB1 蛋白以细胞质或细胞核内出现黄色、棕黄色颗粒认为染色阳性。结果判定标准:细胞内阳性细胞数<10%记为(-)，10%～50% 记为( + )，50%～75% 记为()，> 75% 记为()。( - ) 阴性， ( + ) 记为弱阳性，()、()记为强阳性。

1.3.2反转录PCR 组织标本总RNA提取后反转录合成第一链cDNA，操作按照reverse transcription system kit说明进行。目的基因的相对表达水平根据该基因积分光密度值(integral optical density，IOD)(RT-PCR产物电泳条带的光密度值×面积)与内参GAPDH RT-PCR产物电泳条带的IOD比值算出。

1.3.3Westem-blot免疫印迹 组织标本中总蛋白提取后SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。按标记和实验设计切下膜条，加入相应的一抗(兔HMGB1多克隆抗体1∶300)，酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 1∶30000)与一抗结合。阳性条带以Gdpro4.0版凝胶光密度分析软件进行分析，测定其积分光密度值，HMGB1的相对表达水平根据目的基因HMGB1与内参GAPDH的IOD的比值算出。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。

2 结果

2.1 免疫组织化学检测HMGB1蛋白的表达

在正常胃组织和癌旁组织中，HMGB1呈弱阳性；在高分化癌组织中呈强阳性；在低分化癌组织中，HMGB1蛋白表达不仅在细胞核呈强阳性，在细胞质中也呈强阳性。见图1。

A：正常胃组织；B：癌旁组织；C：高分化GC； D：低分化GC

图1 正常胃组织、癌旁组织和癌组织的免疫组化结果(×400)

2.2 RT-PCR检测组织中HMGB1 mRNA的表达

提取的GC组织、癌旁组织和正常胃组织的总RNA，以GAPDH为内参对照，RT-PCR扩增3组组织中的HMGB1基因，扩增产物经琼脂凝胶电泳后分析显示3组组织的PCR扩增产物均显示特异性条带GC组织中HMGB1 mRNA相对表达水平明显高于癌旁组织和正常胃组织(P<0.001，见表1，图2)；癌旁组织的表达较正常胃组织高，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 HMGB1 mRNA的表达

注：*与胃癌组织比较，P<0．001；Δ与癌旁组织比较，P>0.05

M：marker； A，B：正常胃组织 C，D：GC组织 E，F：癌旁组织

图2 组织中HMGBl mRNA的表达

2.3 HMGBl mRNA的表达水平与胃癌临床病理因素的关系

可以看出：HMGB1 mRNA在不同类型GC中的表达水平不同，其中未分化腺癌的表达水平明显高于其它类型；就分化程度而言，HMGB1 mRNA在低分化腺癌中的表达水平明显高于高分化腺癌；HMGB1 mRNA在有淋巴结转移组的表达水平明显高于无淋巴结转移组(P<0．01)。见表2。

表2 GC组织中的HMGB1 mRNA表达水平与临床病理因素的关系比较

2.4 Western-blot检测HMGBl蛋白的表达

以GAPDH为内参对照，提取GC组织、癌旁和正常胃组织总蛋白。免疫印迹检测结果分析显示：GC组织中HMGB1蛋白表达比值明显高于癌旁组织和正常胃组织，差异有统计学意义 (P<0.001，见表3和图3)。癌旁组织的表达较正常胃组织高，差异无统计学意义 (P>0.05)。

表3 HMGB1蛋白在组织中的相对表达

注：*与胃癌组织比较，P<0．001；Δ与癌旁组织比较，P>0.05

A，B：正常胃组织 C，D：GC组织 E，F：癌旁组织

图3 组织中HMGBl蛋白的表达

3 讨论

GC 是我国常见消化系恶性肿瘤，本病进展快、恶性程度高，患者就诊时常已处于中晚期，手术及介入、药物治疗等措施对GC患者效果均不令人满意。GC 恶性程度高的主要原因在于GC细胞具有很强的侵袭迁移能力，胃血供及淋巴管丰富，癌细胞容易通过血液或淋巴循环等途径转移到其他脏器。因此，寻找与 GC 细胞侵袭、转移有关的新基因可能对阐明 GC 发病机制、寻找肿瘤标志物、确定生物治疗靶点有重要意义。随着分子生物学技术进步，有关GC发生进展的基因研究也取得了很大进展[1]。当前HMGB1与肿瘤侵袭转移的关系已成为研究的热点[2]。HMGBl 是HMG 超家族成员之一，基因位于染色体的 13q12，相对分子量约25kD。有报道表明[3]HMGB1与包括GC在内的多种肿瘤有关，该基因可通过促进肿瘤细胞侵袭迁移而导致肿瘤进展、转移。

本文结果显示：HMGB1蛋白在GC组织中呈现高表达，且主要定位于细胞核；低分化癌中可见细胞核和细胞质中均呈现强阳性表达；HMGB1基因和蛋白在GC组织中的表达水平明显高于正常胃组织和癌旁组织，这与Akaike等的研究结果一致[4-7]。结果提示HMGB1可能与细胞的分裂有关，细胞质中的强阳性表达可能由于细胞受到外界因素的刺激所致。

本文结果还显示：HMGB1 的表达水平与GC的组织学类型、分化程度、有无淋巴结转移等临床病理因素密切有关，提示HMGB1 虽和GC的发生发展有密切关系，但在不同类型的GC发生发展中，其具体的机制不同；在GC的不同阶段，作用也是不同的。有淋巴结转移者与无淋巴结转移者相比 HMGB1 表达强阳性率明显增高，低分化者HMGB1 表达强阳性率明显高于高分化者，表明 HMGB1 可能以某种机制促进了胃癌组织的生长、浸润及转移。在肿瘤发生过程中有大量细胞坏死，向周围释放HMGB1，造成局部组织的慢性炎性环境，进而导致更多的正常细胞发生坏死或癌变，肿瘤细胞长期存活并逐渐向周围扩张。

本文只是明确了HMGB1与胃癌的发生、转移和侵袭有密切的关系；但其具体的作用机制尚不清楚，有待于进一步研究。

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