陈建伟，李鹏飞，姜晓龙，赵妙妙，姚晓磊，黄洋，孟金柱，刘岩，吕丽华

(1.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801)

蛋鸡卵巢CHST11基因CDS序列分析

陈建伟1，李鹏飞2，姜晓龙1，赵妙妙1，姚晓磊1，黄洋1，孟金柱1，刘岩1，吕丽华1

(1.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801)

根据NCBI上已公布其他物种CHST11基因的mRNA序列设计蛋鸡特异性引物，应用RT-PCR方法从其卵巢卵泡中扩增出CHST11的CDS全序列。结果表明：CHST11基因编码产物为不稳定的疏水蛋白，经过BLAST比对发现，和其他物种的CHST11序列相比，同源性高。生物信息学软件分析表明，CHST11蛋白不具有信号肽，在10～40位氨基酸处存在1个跨膜螺旋结构区，其序列预测显示存在13个O糖基化位点。CHST11基因可能参与卵巢肿瘤和卵巢癌的调控，同时也可能与卵泡发育有关。

蛋鸡；CHST11基因；生物信息学分析

碳水化合物磺基转移酶11(CHST11)是参与糖胺聚糖硫酸软骨素(CSs)和硫酸皮肤素生物(DSs)合成过程中一种高尔基体酶[1,2]。而硫酸软骨素(CSs)和硫酸皮肤素(DSs)对神经前体细胞增殖、神经细胞的分化、迁移和神经保护方面起着重要作用[3～6]。同时CHST11参与维持细胞外基质和参与生长因子信号转导途径[7～10]。试验表明，CHST11在人类疾病和恶性肿瘤方面起着重要的调控作用[11～13]，另外，在小鼠胚胎发育过程中CHST11基因突变引起的功能丧失导致严重的骨骼畸形[14]。前期试验已证实CHST11在成年蛋鸡卵巢等组织的高通量转录组测序结果中显示有转录，说明在卵巢组织中有表达，但其结构和功能尚不明确，因此本研究运用生物信息学软件对CHST11蛋白的结构及编码的蛋白质基本性质、结构及功能等进行预测和分析，了解和分析目蛋白的结构特点，为进一步研究CHST11对蛋鸡卵泡发育上奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验动物

试验采用太谷县本地肉鸡，屠宰后取小白卵泡放入液氮冷冻后保存于-80℃冰箱中。

1.1.2 主要试剂

RNAiso Plus，PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser，DNA Marker DL 2000购自TAKARA大连宝生物公司；固相RNase清除剂购自Andybio公司；2×Es Taq Master Mix购自北京康为世纪生物科技公司。琼脂糖、三氯甲烷、、无水乙醇、DEPC、异丙醇等试剂购自北京天根。

1.1.3 引物的设计与合成

根据NCBI网站的Gene Bank公布的各物种的CHST11 CDS序列和鸡CHST11 CDS预测序列(登录号：XM_004937827)，利用Primer 5.0软件设计特异性的引物送交北京六合华大基因公司合成。引物如下：

上游： 5'-CTCCGGCTTCTCTTTCGGC-3'；下游：5'-CAACCCGTCCCTCATTCCAA-3'。

1.2 RT-PCR

首先提取卵泡的总RNA,具体操作步骤参照RNAiso Plus试剂盒提取说明书，利用核酸蛋白浓度测定仪检测总RNA的浓度。然后用RNA PCR Kit Ver.3.0反转录试剂盒进行cDNA第一链合成，依据RT-PCR试剂盒说明，建立20 L反应体系：Total RNA 2 L，5×PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser 4 L，RNase free水加至20 L体系。充分混匀后置于PCR仪中37℃ 15 min，85℃ 5 s，然后取出放入4℃冰箱中备用。

1.3 全CDS序列的扩增

根据使用说明书建立20 L反应扩增体系：2×Es Taq Master Mix 10 L，上下游引物各加入0.8 L，cDNA 300 ng，ddH2O加至20 L体系并充分混匀。反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸5 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，割胶回收后送北京六合华大基因公司进行双向测序。

2 结果与分析

2.1 PCR结果

CHST11 cDNA的扩增产物显示目的片段为1143 bp左右，与预期的结果相符。

图1 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳

2.2 CHST11序列种属间相似性分析

应用NCBI上BLAST分析蛋鸡CHST11 基因CDS序列与原鸡、绿头鸭、猎隼、白喉雀、预测序列的同源性，结果表明：序列同源性分别为99%，96%，94 %，95%。同时利用DNAMAN软件进行的蛋鸡CHST11氨基酸序列与其他物种间同源序列的比对(图2) 。

表1 蛋鸡CHST11基因核酸序列与其它动物间同源序列的相似性比较

2.3 CHST11蛋白的生物学分析

2.3.1CHST11蛋白基本性质分析

根据在线网站软件ProtParam程序对CHST11蛋白质进行基本性质的预测，预测结果目的基因的分子量为41.1333 KD，PI值为9.08，脂肪系数为78.01，亲水性指数总平均为-0.499，说明该蛋白是疏水蛋白。由图3可见，合成目的蛋白的氨基酸共有19种，其中带负电荷的氨基酸残基(Asp+Glu)共有38个，带正电荷的氨基酸残基(Arg+Lys)共有48个；CHST11蛋白不稳定系数为41.13，大于40，为不稳定蛋白。

图2 蛋鸡与原鸡、绿头鸭、猎隼、白喉雀物种间CHST11氨基酸序列比对

图3 CHST11蛋白的氨基酸组成

2.3.2CHST11蛋白质结构预测

信号肽指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移(定位)的N-末端的氨基酸序列，位于分泌蛋白的N端。一般由15～30个氨基酸组成。有一个带正电信号肽的N末端，一个中间疏水序列和一个较长的带负电荷的C末端组成。应用网站上的SingalP 4.1 Server-prediction在线软件对目的蛋白进行信号肽分析(图4)，结果表明，CHST11蛋白不存在信号肽序列，它不属于分泌蛋白。

2.3.3CHST11蛋白跨膜区分析

应用网站上TMHMM在线工具对目的蛋白的跨膜区域进行分析，结果如图5。由图可知，目的蛋白存在1个跨膜螺旋结构区。

图4 CHST11蛋白的信号肽预测图

图5 CHST11蛋白跨膜区预测示意图

2.3.4CHST11蛋白亚细胞定位

利用在线软件Psort Ⅱ分析CHST11基因编码蛋白质的亚细胞定位，结果如图6。该蛋白有34.8%的可能位于线粒体，有26.1%的可能位于内质网，有17.4%的可能位于高尔基体，因此推断CHST11编码的产物主要在线粒体上发挥作用。

图6 CHST11蛋白亚细胞定位预测

2.3.5CHST11蛋白O糖基化位点预测

糖基化是在酶的控制下，蛋白质或脂质附加上糖类的过程，使原蛋白质正常折叠，从而发挥生理作用。通过在线软件分析，在如图7，该蛋白有13个O-糖基化位点。

3 讨论

本研究通过RT-PCR扩增出CHST11基因全序列，并对其蛋白结构、基本性质和细胞定位等生物信息学分析。结果显示蛋鸡CHST11蛋白内含有347个氨基酸，其编码的蛋白是一个疏水性不稳定蛋白。CHST11编码氨基酸序列与原鸡、绿头鸭、猎隼、白喉雀预测序列同源性分别为99%，89%，88 %，98%，因此该基因保守性较强。生物信息学分析表明，蛋鸡CHST11蛋白不具备信号肽，在10～40位氨基酸处存在1个跨膜螺旋结构区，是跨膜蛋白。细胞定位预测显示CHST11编码的产物主要在线粒体上发挥作用。

蛋白O-糖基化是指在蛋白质的Ser/Thr上通过“多肽：N-乙酰氨半乳糖转移酶”的催化作用，加N-acetylgalactosamine (GalNAc) 起始的黏多糖类O-糖基化，O糖基化变化也是细胞恶变和肿瘤发展的普遍特征，已有研究证实CHST11在人类疾病和恶性肿瘤方面起着重要的调控作用[11～13]。CHST11蛋白糖基化位点预测显示，该蛋白有13个O-糖基化位点。因此，我们可以通过对CHST11糖基化位点进行修饰，从而可能对卵巢出现的卵巢癌和卵泡肿瘤的发生进行调控。

试验结果表明CHST11基因在蛋鸡卵巢卵泡上有表达且表达量相对较高，说明CHST11在雌性动物生殖生理过程有着不可或缺的作用。因此，该基因除了可能参与蛋鸡卵巢肿瘤和卵巢癌病理方面有关，也可能参与卵巢生理方面的调节。对CHST11基因的探索，将有利于进一步研究对CHST11 基因及其编码蛋白功能的和表达特性，同时也为下一步研究CHST11基因对蛋鸡卵泡发育生理和病理的影响奠定基础。

图7 CHST11蛋白O糖基化位点预测

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AnalysisoftheCompleteCDSSequenceofCHST11inHenOvaries

Chen Jianwei1, Li Pengfei2, Jiang Xiaolong1,Zhao Miaomiao1, Yao Xiaolei1, Huang Yang1,Meng Jinzhu1, Liu Yan1, Lv Lihua1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China;2.CollegeofLifeScience,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China)

This study aimed to make bioinformatic analysis of the complete CDS sequence of hen ovarianCHST11 gene, specific primers were designed according to theCHST11 mRNA sequence of other species in NCBI. The results showed that the product encoded byCHST11 gene was unstable hydrophobic protein and might have important impact on follicular development, and ovarian cancer. In addition, there was highly homology with thoseCHST11 sequences of other species. One transmembrane domain was predicted among 10～40 amino acids and there were 13 O-glycosylation sites in the sequence, but the signal peptide was not found.

Hen；CHST11；Sequence analysis

2014-03-15

2014-05-10

陈建伟(1987-)，男(汉)，山西运城人，在读硕士，研究方向：动物繁殖。

吕丽华，教授，博士生导师。 Tel：0354-6289295；E-mail：sxaullh@aliyun.com

国家自然科学基金(31172211)；山西省引进人才基金项目(2008080)；山西省国际科技合作项目(2010081002)；国家重点实验室开放课题(SNKF-2012-02);农业部“948”项目(2010-Z43)；山西农业大学横向协作与委托项目(2010HX54)；山西省科技攻关项目(20130311027-2)

S831.2

A

1671-8151(2014)05-0418-05

(编辑：马荣博)