彭新桂，柏盈盈，居胜红

(东南大学附属中大医院 放射科,东南大学医学院 分子与功能影像实验室,江苏 南京 210009)

研究发现脂肪组织的体积和分布是多种疾病的重要致病因素之一。并且,脂肪组织中脂肪酸成分不同也是影响各种疾病的诱因,包括癌症[1]、2型糖尿病[2]和心血管疾病[3]。然而,研究脂肪组织内脂质成分和疾病的发病风险之间的关系非常困难,部分原因是由于传统有创的活检限制了研究的开展。13C磁共振(13C- MR)波谱相对于磁共振氢质子波谱(hydrogen magnetic resonance spectroscopy,1H- MRS),在检测脂肪组织脂质成分方面可以提供更多的特征[4- 5],但是13C- MR由于其相对低敏感性、低空间分辨率和相对高的技术要求而限制了其广泛使用。并且,随着高场强MR仪的广泛应用,1H- MRS的活体、非侵袭性测量脂质及操作相对简单等优点有助于进一步的研究[6]。ob/ob鼠是研究肥胖和糖尿病常用的动物模型[7],本实验采用7.0 T MR成像仪对ob/ob及野生型(wild type,WT)小鼠进行全身单次激发1H- MRS和单体素波谱采集,活体评价脂肪代谢异常ob/ob鼠及其野生对照组全身脂质含量、不同类型脂肪组织脂质成分。

1 材料与方法

1.1 材料

6只ob/ob(C57BL/OlaHsd- Lep)鼠购买于北京军事科学实验动物中心,雄性,10周龄,平均体重(47.5±1.54) g;6只对照组C57BL/6J鼠购买于上海动物模式中心,雄性,10周龄,平均体重(26±0.71) g;7.0 T小动物MR成像仪(Bruker PharmaScan,德国);异氟烷(山东科源制药有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 MR扫描

所有MR成像和1H- MRS采集均在7.0 T Micro MR成像设备上完成。所有小鼠MRI扫描期间均采用吸入麻醉,使用的吸入麻醉剂为异氟烷,与氧气混合后诱导剂量为5%,维持剂量为1%～2%。小鼠头先进俯卧于内径3.5 cm鸟笼式发射与接受线圈内,同时连接呼吸门控监视呼吸节律及幅度,呼吸频率保持25～35次·min-1,并予保温。所有动物先后分别进行MR成像及1H- MRS采集。

全身1H- MRS波谱采集使用单个RF脉冲序列,重复时间为5 000 ms,射频脉冲持续时间为10 ms,重复次数为32。计算整体的甘油三脂(triglyceride,TG)含量按照下列公式：TG含量=TG峰下面积/(水峰下面积+TG峰下面积)×100%。

常规T1加权成像(T1WI)提供准确的1H- MRS体素的定位。采用多层面多回波成像序列(multiple slices multiple echo, MSME),扫描参数： 重复时间为500.0 ms,回波时间为15.0 ms,翻转角为180°,重复次数4次,无间距扫描。无脂肪抑制。成像范围为从颈部至肛门,轴位扫描。

采集1H- MRS运用点分辨自旋回波波谱技术(point- resolved echo spin spectroscopy,PRESS),重复时间和回波时间分别为2 500 ms和20 ms;体素为2.0 mm×2.0 mm×2.0 mm,重复次数为512。体素分别放置在棕色脂肪(brown adipose tissue,BAT)和白色脂肪(white adipose tissue,WAT),具体放置位置：BAT主要选择颈肩部肩胛间区采集,WAT选择下腹部生殖腺周围,相应部位位于磁场中心。均需避开大血管及边缘部位。采集前先自动匀场,使被选体素区域磁场均匀性最优化,在体波谱采集均不压水,水峰半高宽<45 Hz。在Topspin软件上将采集的自由感应式衰减信号进行傅立叶转换,再将基线和相位矫正后进行分析。波谱数据分析时,首先确定4.7 ppm水峰为参考峰,将这个参考峰的峰下面积固定为1,所有其他峰的积分值都随之标准化。按下列公式计算脂质含量(FC)：FC=100%×B峰下面积 /(水峰下面积+B峰下面积)

TG峰为B峰,位于1.3 ppm,计算TG在总体氢质子中所占百分比。水峰的化学位移为4.6～4.8 ppm,TG峰的化学位移为1.2～1.4 ppm，计算公式参照文献[8]。

分别计算饱和脂肪酸(fraction of saturated fatty acids,FS)、不饱和脂肪酸(fraction of unsaturated fatty acids,FU)、双不饱和脂肪酸(fraction of diunsaturated fatty acids,FDU)含量及多聚不饱和程度(polyunsaturation degree,PUD),A峰的化学位移为0.8～1.0 ppm,D峰的化学位移为1.9～2.1 ppm,E峰的化学位移为2.1～2.3 ppm,F峰为2.7～2.9 ppm，计算公式如下[8- 9]：FU=D峰下面积/(2×E峰下面积);FS=1-FU;FDU=F峰下面积/E峰下面积;PUD=F峰下面积/(2/3)A峰下面积。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 整体1H- MRS测量TG含量

单次激发1H- MRS可以在活体上整体定量脂质蓄积程度。全身波谱显示两个峰：一个水峰在4.7 ppm,一个是TG峰在1.3 ppm。ob/ob鼠TG氢质子含量占总体氢质子含量的52.93%±3.66%,而WT鼠为7.88%±0.79%,ob/ob鼠显著高于WT鼠,两者间差异有统计学意义(P<0.001)(图1)。

图1全身单次激发1H-MRS波谱图及全身TG含量比较

Fig11H-MRSofallbodywithasingleradiofrequencypulsesequence

2.2 单体素1H- MRS定量WAT及BAT的脂质含量及成分分析

分别采集分析颈肩部BAT及生殖腺周围WAT的1H- MRS(图2)。ob/ob鼠和WT鼠BAT的脂质含量分别为93.1%±1.6%、74.4%±1.6%;两组鼠WAT的脂质含量分别为95.6%±1.6%、90.7%±4.8%,测量结果显示ob/ob鼠BAT的脂质含量显著高于WT鼠(P<0.05),但是两组鼠WAT的脂质含量差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。HE染色结果显示,WT鼠BAT脂肪细胞较小,血管丰富,而ob/ob鼠BAT脂肪细胞内见多量脂滴,较WT鼠脂肪细胞体积明显增加,血管较稀疏;两者WAT形态基本一致,但是ob/ob鼠WAT细胞较WT鼠体积明显增大(图3)。

图21H-MRS采集BAT和WAT体素放置位置(A)及波谱图(B)

Fig2Thevoxelof1H-MRSinBATandWAT

Tab 1 The lipid contents of the BAT and WAT in vivo by MRI and %

ob/ob鼠WAT的PUD低于野生对照组,分别为0.236±0.043和0.309±0.043(P<0.05);ob/ob鼠WAT的FDU也低于对照组,分别为0.211±0.023和0.297± 0.035(P<0.05),但是ob/ob鼠WAT的FU与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),ob/ob鼠BAT的PUD、FU及FDU与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

ob/ob鼠WAT的FDU低于BAT的FDU,分别为0.211±0.023和0.249±0.048,差异有统计学意义(P<0.05);ob/ob鼠WAT与BAT的PUD分别为0.236±0.043、0.272±0.063,FU分别为0.774±0.063、0.743±0.069,差异均无统计学意义(P>0.05)。WT鼠WAT的FU高于BAT,分别为0.789±0.063和0.681±0.039,差异有统计学意义(P<0.05);WT鼠WAT与BAT的PUD及FDU间差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

图3BAT及WAT的HE染色结果×200

Fig3HEstainingofBATandWAT×200

表2WAT和BAT活体1H-MRS脂肪成分分析(n=6)

Tab2ThelipidcomponentanalysisinBATandWATinvivobyusing1H-MRS(n=6)

鼠 别WATBATPUDFUFDUPUDFUFDUob/ob鼠0.236±0.0430.774±0.0630.211±0.0230.272±0.0630.743±0.0690.249±0.048aWT鼠0.309±0.0430.789±0.0630.297±0.0350.341±0.0680.681±0.039a0.262±0.053t值-3.453-0.496-6.574-1.6701.713-0.392P值0.0030.6250.0000.1330.1300.705

与WAT比较,aP<0.05

3 讨 论

3.1 单次激发1H- MRS评价小鼠全身脂质含量

脂肪组织分布全身,受性别、年龄、饮食、体育锻炼、激素及药物[10]等因素影响,同时,脂肪分布的部位不同引起心血管风险因素的关联度显著不同[11]。ob/ob鼠纯合子缺乏瘦素mRNA的表达导致无义突变,从而引起无活性的瘦素增加。瘦素在调节体重、脂肪沉积及能量代谢方面均发挥重要作用,除了在能量储备上起非常重要的作用外,在调节脂肪酸及葡萄糖代谢上也起关键作用[12- 13]。脂肪组织单次激发1H- MRS使活体非侵袭性整体定量研究脂质累积程度成为可能,检测结果显示ob/ob鼠TG含量显著高于WT鼠。研究也证实,在MRI上测量全身WAT体积,结果表明ob/ob鼠显著高于正常对照组[6,9]。该方法测量全身脂质含量比整体光密度测量法或同位素测量法更简便易行,可以成为评价肥胖的一个敏感指标[14]。

3.2 单体素1H- MRS评价WAT及WAT脂质含量及脂质成分

根据脂肪组织的不同功能和颜色分为WAT和BAT。WAT的主要功能是以TG形式储存能量,在食物不足时,为了代谢需要动员储存的TG。而 BAT的主要功能是能量消耗和产热[15]。形态学上,WAT细胞内含有单一大脂滴,而BAT细胞是多房腔的,包含多重脂滴。BAT不同于WAT，含有丰富的血管和神经支配。BAT由于含有丰富的血管和稠密的线粒体而呈棕色。在寒冷诱导下,BAT快速上调解耦连蛋白Ucp1活力,促使BAT细胞质子转运和分解ATP产生热能。在小型哺乳动物,BAT活力受损被认为在脂肪代谢异常和代谢综合征中起重要作用。同时,WAT和BAT都含有调节脂质合成、水解和分泌激素的酶类,例如瘦素,调节能量动态平衡。因而活体检测WAT及BAT变化显得尤为重要[16]。

在胚胎形成第15天,在肩胛间区BAT结构就已形成,而WAT在出生后形成,主要位于腹股沟、腹膜后、性腺、肠系膜和皮下。颈部及肩胛间区在解剖上是BAT组织的分布范围,由于ob/ob鼠与WT鼠的BAT的血管含量及脂肪细胞内脂滴不一致,单体素MRS方法测量BAT中脂肪和水的含量也不同,ob/ob鼠与WT鼠BAT的脂肪含量分别为93%和74%,ob/ob鼠BAT脂肪含量显著高于WT鼠,组织病理学上也证实ob/ob鼠BAT脂肪细胞内存留大量的脂滴,脂肪细胞明显增大,而WT鼠BAT脂肪细胞小,存储的脂滴少,血管丰富。但是WT鼠颈部及肩胛间区BAT体积较小,MRS的体素内可能包含周围肌肉等其他组织而影响数据的准确性。

单体素1H- MRS在7.0 T场强下能够采集化学位移0.9～5.3 ppm范围内10个峰,可以计算FS、FU、FDU含量及PUD。单体素1H- MRS体外实验研究[17]表明,测量100%油的FS及FU相对含量,分别为0.15和0.85,与实际脂肪成分数据一致(脂肪100%, FS 15 g, FU 85 g);同时测量PUD为0.03,这对应用于活体进行脂肪的定性研究非常重要,其不同的含量有着不同的病理生理意义：不同的脂肪代谢异常情况下脂肪组织FS及FU的相对含量会发生改变;不同脂肪组织如WAT和BAT的PUD也有不同,并且在生理状态下,PUD还受年龄、饮食及生存环境等因素影响。ob/ob鼠和WT鼠的内脏WAT组织的PUD分别为0.24和0.31。Calderan等[9]测量ob/ob鼠皮下WAT的PUD,结果为0.524 7;而Lanati等[18]测量WT大鼠皮下WAT的PUD为0.68。由此证实,PUD受不同类型、不同部位脂肪组织、不同品系等多种因素影响。文献[19]报道,1H- MRS测量皮下脂肪组织中FS为27%～29%,FDU为23%～24%,本实验结果显示内脏WAT和BAT FS为21%～32%,FDU为21%～28%,并且显示ob/ob鼠WAT FDU高于WT鼠,ob/ob鼠WAT FDU高于BAT。Ren等[19]利用活检组织气相色谱分析(金标准)检测人皮下及骨髓脂肪组织FDU的含量为17%～18%,而波谱测量结果为23%～24%,较金标准检测结果高估。可能的原因主要有以下3个：(1) 大分子或含水代谢产物的化学位移与脂质的化学位移有所重叠;(2) 几种不同脂肪酸的活体氢质子波谱信号有轻度不同化学位移;(3) T2矫正是非常关键的,甚至比T1矫正更为重要。所以,1H- MRS需要进一步改善采集及后处理方法。

单次激发全身1H- MRS及单体素1H- MRS不仅可以实现活体观察全身脂质含量及脂肪组织脂质含量,也可以分析不同脂肪组织中脂质成分的动态变化,7.0 T1H- MRS因其简单、快速、无创、无痛等优点成为进一步研究脂质代谢的新方法。

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