张 明 温都苏 任 明 李然伟 刘禄成

(吉林大学第二医院泌尿外科，吉林 长春 130041)

膀胱尿路上皮癌男性明显多于女性，且易复发。随着对肿瘤分子生物学研究的深入和癌基因学说的确立，靶向基因制剂联合化疗预防肿瘤治疗后复发的抗肿瘤治疗策略成为目前肿瘤研究与治疗的热点之一。缺氧诱导因子(HIF)-1α在多种恶性肿瘤组织中表达，并被证实既能促进肿瘤生长也与化疗耐药和患者不良预后有关〔1～3〕。本文针对HIF-1α设计了反义HIF-1α联合丝裂霉素C(MMC)治疗裸鼠原位膀胱癌的实验研究，旨在为临床膀胱癌的治疗制定更加实用有效的新方案提供参考。

1 材料与方法

1.1主要材料来源 人膀胱癌T24细胞株购自中国科学院上海细胞所。BALB/C裸鼠购自中国医学科学院实验动物研究所。原位凋亡检验法(TUNEL)试剂盒和噻唑蓝(MTT)比色仪分别购自北京中山生物公司和美国Sigma公司。MMC来自日本山丸株式会社制药公司。ESDREF1.5T三维核磁扫描仪购自德国西门子公司。反义HIF-1α载体由本实验室构建〔4〕。

1.2实验方法步骤 ①按照参考文献〔4〕所述方法步骤，构建人膀胱癌细胞裸鼠原位膀胱移植瘤模型和疗效评价及瘤体标本处理。选取30只瘤体大小几乎相同的成瘤裸鼠，随机分为三组，10只/组，每隔7 d分别经尿道膀胱灌注反义HIF-1α载体+MMC，反义HIF-1α载体，MMC，均灌注4次/组，28 d为1个疗程。每隔9 d，即灌注后的第2天用ESDREF1.5T核磁扫描仪检测肿瘤体积。在实验结束后的第5天处死所有裸鼠，迅速切开膀胱，完整剥取瘤体称重，并用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，以长(mm)×宽(mm)计算出肿瘤大小，然后按病理常规要求切片备检。② MTT法检测瘤细胞增殖。5 μm厚的组织切片依次脱蜡→脱水→双氧水封闭→滴加MTT显色液→磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤→抗地高辛抗体孵育→苏木素复染。以PBS代替MTT显色液作为阴性对照，阳性对照切片经DNA酶Ⅱ处理后按MTT法程序染色，实验重复3次。结果判定：细胞胞浆呈棕黄色者为增殖细胞阳性。每张切片观察5个视野，每个视野计数100个细胞，胞浆呈棕黄色的细胞在切片视野中所占百分率的均值即为瘤细胞的增殖率。见图1。③ TUNEL法检测瘤细胞凋亡率。继续用②中处理的标本，不同的是，更换MTT显色液为TUNEL反应液，用PBS代替TUNEL作为阴性对照。阳性对照切片经DNA酶Ⅰ处理后按TUNEL试剂盒所示染色步骤进行。结果判定：胞核呈黄褐色的细胞为凋亡细胞，其在每张切片，每个视野计数100个细胞中所占百分率的均值为瘤细胞凋亡率。见图1。

图1 T24细胞的增殖、凋亡情况(×400)

1.3统计学方法 应用SPSS15.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1联合和单一用药治疗对成瘤裸鼠肿瘤细胞增殖和凋亡的影响 MTT法检测结果 反义HIF-1α制剂+MMC用药和反义HIF-1α载体及MMC单独治疗组瘤细胞的增殖率分别是：(19.8±3.7)%,(48.6±5.9)%,(35.8±7.4)%。各治疗组肿瘤细胞虽均发生不同水平的增殖抑制现象，但以联合用药组增殖抑制最为明显，与单独用药的两组分别比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。TUNEL法检测瘤细胞凋亡率的结果依次是联合组(82.6±5.7)%,反义HIF-1α组(43.7±8.4)%,MMC组(57.9±4.8)%,联合用药组瘤细胞凋亡率明显高于单独用药组(P<0.05)。

2.2联合和单一用药治疗对成瘤裸鼠肿瘤生长的影响 联合治疗组、反义HIF-1α和MMC治疗组的肿瘤体积从第9、21、30天开始，均不同程度的逐渐变小。实验结束后测得联合组和单独组的肿瘤大小依次是〔(15.28±6.37)mm2〕，〔(31.94±5.72)mm2〕，〔(27.85±3.81)mm2〕。单独用药两组相对比，差异虽无统计学意义(P>0.05)，但联合用药组分别与单一用药组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

2.3联合和单一用药治疗对成瘤裸鼠淋巴转移的影响 单纯基因制剂和单纯化疗治疗的10只成瘤裸鼠中均出现4只膀胱外盆腔淋巴结转移，转移率高达40%，而基因治疗+化疗治疗的10只成瘤裸鼠中仅1只转移，转移率为10%。组间比较差异显著(P<0.01)。

3 讨 论

研究表明，缺氧在实体肿瘤中普遍存在，缺氧微环境不仅参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、转移及血管生成等调控，而且上调耐药基因表达，选择性抗凋亡〔5～7〕。HIF-1α为近年来发现的一种是细胞在基因转录水平协调缺氧变化的主要调节因子，其过度表达时可明显抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞增殖，从而加速肿瘤生长转移〔8，9〕。锁核酸(LNA)类寡核苷酸代表第三代反义技术，对靶向mRNA具有很高的特异亲合性和强大的组织稳定性，人们将其主要应用于基因研究和抑制肿瘤基因表达方面〔10，11〕。本研究结果提示：① 膀胱癌T24细胞株中过表达的HIF-1α可以通过反义HIF-1α载体抑制。② 单一基因制剂或细胞毒抗癌药物虽对肿瘤细胞有抑制作用，但不能达到理想的治疗效果。③ 基因制剂与化疗药物联合治疗，明显优于单一用药。

4 参考文献

1Nurwidya F，Takahashi F，Minakata K,etal.From tumor hypoxia to cancer progression：the implications of hypoxia-inducible factor-1 expression in cancer〔J〕.Anat Cell Biol,2012;45(2):73-8.

2Semenza GL.Hypoxia-inducible factors：mediators of cancer progression and targets cancer therapy〔J〕.Trends Pharmacol Sci,2012;33(4):207-14.

3Noman MZ，Messai Y，Carre T,etal.Microenvironmental hypoxia orchestrating the cell stroma cross talk tumor progression and antitumor response〔J〕.Crit Rev Immunol,2011;31(5):357-77.

4朱德淳，李然伟，刘禄成，等.重组腺病毒载体携带反义微小RNA-21对膀胱癌细胞生长的作用〔J〕.中国实验诊断学，2010;14(9):1351-3.

5Zhu P，Ning Y，Yao L,etal.The proliferation appotosis invasion of endothelial-like epithelial ovarian cancer cells induced by hypoxia 〔J〕.J Exp Clin Cancer Res,2010;29(6):124.

6Liu L，Ning X，Sun L,etal.Hypoxia-inducible factor-1 alpha contributes to hypoxia-induced chemoresistance in gastric cancer〔J〕.Cancer Sci，2008；99(1):121-8.

7Liao D，Corle C，Seagroves TN,etal.Hypoxia -inducible factor-1 alpha is a key regulator of metastasis in a transgenic model of cancer initiation and progression〔J〕.Cancer Res,2007;67(2)：563- 72.

8Liu F，Wang P，Jiang X,etal.Antisense hypoxia-inducible factor-1 alpha gene therapy enhances the therapeutic efficacy of doxorubicin to combat hepatocell ular carcinoma〔J〕.Cancer Sci,2008;99(10):2055-64.

9Jemal A，Siegel R，Xu J,etal.Cancer statistics,2010〔J〕.CA Cancer J Clin，2010;60(5)277-300.

10Stenvang J，Silahtaroglu AN，Lindow M,etal.The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics〔J〕.Semin Cancer Biol，2008；18(2):89-102.

11Greenberger LM，Horak ID，Filpula D,etal.A RNA antagonist of hypoxia-inducible factor-1alpha，EZN-2968，inhibits tumor cell growth〔J〕. Mol Cancer Ther，2008;7(11):3598 -608.