陈 霞 王永红 陈国俊 康卓君 王小林

(重庆医科大学附属第一医院神经内科 重庆市神经病学重点实验室，重庆 400016)

早期营养不良是成年后发生外周胰岛素抵抗(IR)的重要危险因素〔1～5〕。而脑内胰岛素信号系统与认知功能密切相关，脑内IR可致认知功能障碍〔6,7〕。有研究表明，早期营养不良可导致成年后子代认知功能下降〔8～10〕，但具体机制尚不明确。本实验观察仔鼠海马胰岛素信号通路中关键信号蛋白磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的催化亚基p110α及其可能相关的信号下游分子β-淀粉样蛋白(Aβ)1～42的表达量变化，探究生命早期营养不良对老年期认知功能的影响和可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康成年SD大鼠8只，雌性，清洁级，体重200～220 g，由重庆医科大学实验动物中心提供。

1.2主要试剂 兔抗PI3Kp110α单克隆抗体(美国Cell Signaling公司)、兔抗Aβ1～42多克隆抗体(英国Abcam公司)、抗β-actin小鼠单克隆抗体、BCA蛋白浓度测定试剂盒和超敏ECL化学发光试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所)、磷酸化蛋白提取试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)、过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(武汉博士德生物工程有限公司)、羊抗兔IgG/HRP、免疫组化染色试剂盒和DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)、短效胰岛素诺和灵R(丹麦诺和诺德公司)。

1.3方法

1.3.1早期营养不良模型的制备 将8只雌鼠按雌雄比例2∶1与雄鼠合笼后，以次日晨发现阴栓记为怀孕0 d，正常饲养14 d后，将孕鼠随机分为正常对照组(NC组)和早期营养不良组(EM组)，每组4只，单笼喂养于恒温(20±2)℃、12 h∶12 h明暗交替的动物房内。采用Coupé等〔11〕造模方法：NC组不限量饮食。EM组仅给予50%NC组的食量，即E14-E21为12 g/d，E21-P6逐渐加量至22 g/d，P7-P13为27～31 g/d，P14～P21为 35～40 g/d。NC组和EM组每只母鼠均哺乳相同数量的仔鼠(8只)以保证每只仔鼠哺乳均衡。断乳后留取其中的雄性仔鼠(NC组和EM组各16只)予正常饮食饲养至15月龄(动物饲料由重庆医科大学实验动物中心提供，含有16%蛋白质、3%脂肪、60%碳水化合物，维生素适量)。

1.3.2胰岛素耐量试验(ITT) 仔鼠9月龄、15月龄时，采用胰岛素耐量试验评估仔鼠外周胰岛素敏感性〔12〕，若血糖下降幅度越小说明对胰岛素越不敏感。仔鼠禁食过夜后，首先检测尾静脉空腹血糖(FPG)。然后腹腔注射胰岛素(11 U/Kg,用生理盐水稀释),分别于15、30、60 min后检测尾静脉血糖。

1.3.3Morris水迷宫实验 仔鼠15月龄时，应用Morris水迷宫实验测定其空间学习记忆能力〔13〕。将水池壁的4个等距离点定义为东(E)、南(S)、西(W)、北(N)，并贴上不同形状的标记物。将平台放于SW象限，低于水面1～2 cm。①定位航行实验：训练5 d，4次/d，每只仔鼠分别从4个不同点入水。用60 s内找到平台的时间(逃避潜伏期)表示。②空间探索实验：训练1 d，撤去平台，入水点为NE象限。记录大鼠在30 s内游泳轨迹，分别计算其跨越平台次数、平台象限活动时间百分比。

1.3.4Western 印迹检测海马PI3Kp110α表达水平 分别取9月龄、15月龄仔鼠大脑海马组织100 mg放入匀浆器，按照磷酸化蛋白提取说明书加入现配制好的裂解液0.5 ml，冰上低温研磨充分后，离心取上清液，BCA法测定蛋白浓度，加入1/4蛋白体积的5×上样缓冲液配制成终浓度为5 μg/μl的上样蛋白，煮变性后备用。配8%的分离胶和5%的上层胶，每孔上样15 μl，SDS-PAGE垂直电泳，PVDF膜转膜140 min，5%牛血清白蛋白封闭60 min；分别加一抗PI3Kp110α单克隆抗体(1∶1 000)和抗β-actin小鼠单克隆抗体(1∶1 000)，4℃孵育过夜后37℃复温60 min，TBST洗膜；分别加HRP标记的羊抗兔IgG(1∶4 000)和羊抗小鼠IgG(1∶6 000)37℃孵育60 min，TBST洗膜；ECL试剂盒显色。使用Quantity One软件测定各条带的平均光密度值，分别将PI3Kp110α与对应的β-actin显色条带的光密度值的比值作为PI3Kp110α蛋白的相对表达量。

1.3.5免疫组化(IHC)法检测大脑PI3Kp110α、Aβ1～42表达水平 用10%水合氯醛(按0.35 ml/100 g腹腔注射)分别将9月龄、15月龄仔鼠麻醉，采用心脏灌注固定法，先生理盐水后4%多聚甲醛溶液灌注，取脑、固定、石蜡包埋、制作切片。免疫组织化学采用SP法：石蜡切片常规脱蜡至水，3%H2O2孵育15 min，放入柠檬酸钠(pH6.0)溶液中行热修复，冷却至室温后用山羊血清液封闭30 min，再分别加一抗PI3Kp110α(1∶50)和Aβ1～42(1∶50)，4℃过夜。PBS冲洗，滴加二抗后37℃孵育30 min，PBS冲洗，滴加HRP标记的链霉卵白素工作液并37℃孵育30 min，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，1%盐酸酒精分化，碳酸锂返蓝，脱水、透明、中性树胶封片。以PBS代替一抗做阴性对照。每只仔鼠选取3张切片，每张切片随机摄取3个视野，图像采集后用Image-Pro Plus6.0软件测定阳性物质的平均光密度值。

1.4统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行t检验和方差分析。

2 结 果

2.1仔鼠出生时体质量 NC组仔鼠平均出生体质量为(7.99±1.03)g，明显高于EM组〔(5.45±0.47)g，P<0.01〕。

2.2ITT 9月龄时，NC组与EM组的FPG无差异〔(4.83±0.33)mmol/L vs (5.06±0.32) mmol/L,P>0.05〕；腹腔注射胰岛素后，EM组在15 min和30 min时平均血糖分别为FPG的86.94%和71.15%，下降幅度均小于NC组(P<0.05)。15月龄时，EM组的FPG于NC组〔(5.09±0.41) mmol/L比(4.55±0.46) mmol/L),P<0.05〕；EM组在30 min时平均血糖较FPG下降了25.39%，低于NC组的38.68%(P<0.01)。可见，EM组在不同时期外周胰岛素敏感性均低于NC组。

2.3Morris 水迷宫实验 定位航行实验中，EM组逃避潜伏期较NC组明显延长(P<0.05)，见表2。空间探索实验中，与NC组相比，EM组穿越平台次数减少(1.13±0.64 vs 2.50±1.20,P<0.05)，平台象限活动时间百分比显著减小〔(26.00±4.42)% vs (35.07±4.13)%，P<0.01〕。

表2 两组仔鼠逃避潜伏期的比较

2.4Western 印迹法检测海马PI3Kp110α的表达 9月龄时，EM组海马PI3Kp110α的相对表达量明显低于NC组〔(0.45±0.26)比(1.12±0.18),P<0.01〕。15月龄时，EM组也低于NC组〔(0.44±0.30)比(1.01±0.35),P<0.05〕。 见图1。

2.5IHC检测PI3Kp110α、Aβ1～42的表达。

2.5.1IHC检测海马PI3Kp110α的表达 PI3Kp110α的免疫组化结果与免疫印迹一致(图2)。在不同月龄时，NC组海马CA1区神经细胞内棕黄色阳性表达颗粒均多于EM组。

2.5.2IHC检测 Aβ1～42的表达 15月龄时，EM组Aβ1～42在皮质和海马表达的平均光密度值1.15±0.24、0.76±0.06，均高于NC组0.82±0.18、0.88±0.13，但差异没有统计学意义(P>0.05)。见图3。

1，2：9月龄NC组；3，4：15月龄NC组；5，6：9月龄EM组；7，8：15月龄EM组

↑：示右下角放大400倍区域

图3 15月龄皮质大鼠及海马Aβ1～42的表达(SP,×40)

3 讨 论

生命早期遭受限量饮食可导致子代出生时体质量偏低，体质量是反映个体近期营养状态的重要指标。本实验采用围生期母鼠限量饮食造模，实验组出生时的平均体质量比对照组低约32%，说明实验组仔鼠营养不良。早期营养不良可致胰岛素信号传导通路分子异常，胰岛素信号传递受阻或减弱，最终导致IR的发生〔14〕。本实验中ITT结果显示，与对照组相比早期营养不良模型组仔鼠在9月龄和15月龄时，胰岛素敏感性均降低，说明实验组已存在外周IR。

脑内胰岛素信号途径可能与外周信号途径相近，其中PI3K信号途径是脑内胰岛素受体后主要信号通路，该通路通过参与调节血糖平衡而影响大脑的新陈代谢、神经递质的释放和高级认知功能〔15,16〕，还可调节阿尔茨海默病(AD)病理学特征之一老年斑中Aβ的代谢〔17～19〕。PI3K是这一路径中的关键信号蛋白，该蛋白由p85 调节亚基和p110 催化亚基形成异二聚体，其中发现p110α是PI3K家族中响应胰岛素信号的最重要的分子。Sopasakis等〔18〕在肝脏中敲除p110α后导致胰岛素敏感性和葡萄糖耐受降低。本研究结果显示，早期营养不良组海马中PI3Kp110α的表达量明显低于正常组，这可能是产生中枢IR的分子机制之一。有研究表明，中枢IR源于外周IR〔19，20〕，这可能解释了本实验中早期营养不良发生中枢IR的原因。

早期营养影响成年后健康〔21〕，而神经系统的发育最易受早期营养状况的影响。早期营养不良可导致成年后学习记忆下降等认知功能障碍〔8～10〕。本实验研究表明，围生期母鼠限量饮食可造成子代早期营养不良，成年后出现外周IR，并通过下调海马PI3Kp110α的表达量诱导脑内IR，从而使学习记忆能力下降。由此可推断，海马PI3Kp110α表达量的异常可能是早期营养不良致老年期认知功能障碍的分子基础，这为生命早期遭受食物短缺老年期发生认知功能障碍的人群提供了新的治疗靶点。脑胰岛素信号系统紊乱可能参与Aβ的聚集以及AD的形成〔20,22,23〕，但早期营养不良是否可通过脑IR而致AD的发生还需要进一步的研究。

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