荣良燕姚拓， 冯 今，杜笑村，李儒仁，陈 龙

(1.甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃 兰州 730070； 2.甘肃省草原技术推广总站，甘肃 兰州 730046；3.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070)

我国农牧业生产中，氮、磷素供应量直接影响作物潜在生产性能和生态功能的发挥，而化肥一直被认为是解决这一问题的主要途径。在经济落后且土地贫瘠的西部地区，大量使用高成本的化肥是增加农牧业生产成本的主要因素之一[1]。随着化肥施用量的增加，出现了肥效下降、利用率降低等现象，此外，生产化肥对非再生能源消耗大，破坏土壤结构及微生物多样性等，加剧土壤退化。因此，探寻新的低能耗、低排放及环境友好型肥料以部分替代化肥，实现高效益的循环农业已显得很重要。

研究表明，PGPR微生物肥具有良好的固氮、溶磷、分泌植物激素及抑制植物致病菌的能力，同时具有生长快、竞争力强、利用碳源谱广等特点[2-4]。接种PGPR复合制剂，与常规施肥相比，大豆早熟2～3 d，根瘤数增加3.0～26.8个/株，百粒质量增加0.2～0.8 g，产量提高3.2%～12.7%[5]；施用PGPR接种剂替代20%～30%化肥，玉米株高、地上植物量、穗长、单位面积穗数、穗粒数和经济产量等均有提高[6]；增施促生菌肥与常规施肥相比，地下块茎部分钾素吸收率高出9.98%，氮素吸收率高出19.61%，磷素吸收率高出20.1%，马铃薯产量比常规施肥提高12.4%[7]。试验利用分离自小麦、苜蓿、三叶草、豌豆等植物根际的优良PGPR菌株制成微生物肥，替代20%～30%的化肥，研究其对豌豆生长的影响，以期为定向利用微生物资源提供理论支撑，为发展循环农业，节约购买性资源投入量提供新途径。

1 材料和方法

1.1 研究区概况

试验地设在甘肃省武威市凉州区，海拔2 100～4 800 m，地处N 37°23′～38°12′，E 101°59′～103°23′，年均温7.8 ℃，极端气温最高36.6 ℃，最低-29.8 ℃。年均降水量60～160 mm，蒸发量1 400～3 010 mm，年日照时数2 200 h，无霜期85～165 d，pH7.2～7.5。

1.2 供试材料与设计

1.2.1 供试材料 试验豌豆(Pisumsativum)品种MZ-1，发芽率85%。菌肥甲由甘肃农业大学草地微生物试验室提供菌种自制；菌肥乙为成品微生物肥料冀生物磷钾肥。化肥尿素(含N 46%)，磷二铵(含P 46%，N 18%)。

1.2.2 试验设计 微生物肥甲的筛选：从PGPR供试菌株Lx191、Jm92、Jm170、LM4-3、LS1-1、LS1-2、LS3、LS13、LHS4-1、LHS4-2、LHS8、LHS9、LHS11、LHS14、LH11和LH12-3(由甘肃农业大学草地微生物试验室提供)，选出具有农牧业应用潜力的优良促生菌株混合。

筛选方法：(1)菌株溶磷能力测定采用溶磷圈法和钼蓝比色法[8-10]；(2)菌株固氮酶活性测定利用气相色谱仪(GC)，采用乙炔还原法测定菌株固氮酶活性[9-11]；(3)菌株分泌生长激素(IAA)测定用比色法[12]。

根瘤菌扩大培养：将保存在4 ℃培养基(YMA)斜面上的豌豆根瘤菌株GDB27(由甘肃农业大学农学院提供)，置于28 ℃环境下1～2 h，画线接种于YMA固体平板培养基上，3～4个重复，28 ℃培养24～48 h。待菌株充分生长后，挑取典型的单菌落划线接种到YMA固体斜面培养基置于28 ℃培养箱。48 h后，取3～5 mL无菌水于试管中，制成菌悬液。500 mL三角瓶中装入200 mL灭菌的YMA液体培养基，在无菌环境下将菌悬液2～3 mL置于三角瓶中，150 r/min，28 ℃摇床培养5～7 d。菌株充分生长后，测定发酵菌液的OD660 nm值。当OD660 nm值>0.5时，发酵菌液中的细胞数目>109个/mL。无菌条件下，将发酵菌液注入灭菌后的玻璃瓶中密封常温保存。YMA培养基成分为NaCl 0.1 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7 H2O 0.2 g，甘露醇10.0 g酵母膏0.5 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.8。制作方法参照文献[13-15]。

PGPR菌肥制作：将3～5 mL灭菌水置于接种好的混合供试PGPR菌株的斜面上，制成菌悬液。在500 mL三角瓶内装入200 mL LB液体培养基，灭菌后置于室温下2～3 d，经检验无污染后，分别将各菌株的菌悬液1 mL装入LB液体培养基三角瓶中，28 ℃，125 r/min摇床上培养2～3 d。待菌株充分生长后，测定发酵菌液OD660 nm值。当OD660 nm值>0.5时，发酵菌液中的细胞数目为109个/mL，无菌条件下，将发酵菌液注入灭菌玻璃瓶中密封常温保存。LB培养基成分为：酵母膏 5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5～10 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.5。制作方法参照文献[13-15]。

将根瘤菌菌肥和PGPR菌肥发酵菌液以1∶1的比例混合制成微生物肥甲。

田间试验设3个处理和对照(CK)，处理A菌肥甲+70%化肥；处理B 菌肥乙+70%化肥；处理C 菌肥甲+80%化肥； CK 全量化肥(100%化肥)，各处理重复3次，共12个小区，每小区面积2.8 m×8.0 m，间距20 cm。CK全量化肥磷二胺为300 kg/hm2，尿素120 kg/hm2(纯N 105 kg/hm2，纯P 135 kg/hm2)。

拌种：每1 000 mL菌肥拌种20 kg(CK不拌种)，置阴凉处2 h后可播种。播种量225 kg/hm2，点播，行距0.25 m，株距0.10～0.15 m。

1.3 测定指标及方法

株高：分别在豌豆的初花期(5月20日)、盛花期(6月16日)和成熟期(7月4日)测量各处理的植株绝对株高，每小区随机取10～15个样，计算平均值。

地上生物量：在初花期、盛花期和成熟期，每小区随机取样10株测量地上部分鲜重，待取样的植株完全风干至恒重后称量干重，计算平均值。

地下生物量：在初花期、盛花期和成熟期，随机选取10株，清洗干净，测量其根长、用扫描仪测量根体积和根表面积，最后风干根样至恒重称量干重，计算出平均值。

考种及籽粒产量：成熟期豌豆样品完全风干后对单株结荚数、单荚粒数及单株粒重进行记录。将豌豆籽粒剥离后测量千粒质量及籽粒产量(经济产量)，经济产量测量方法：各小区除去边行0.5 m后单打单收，以打碾产量折算公顷产量，计算平均值。

2 结果与分析

2.1 菌株培养及其促生特性

对供试的Lx191、Jm92、Jm170、LM4-3、LS1-1、LS1-2、LS3、LS13、LHS4-1、LHS4-2、LHS8、LHS9、LHS11、LHS14、LH11和LH12-3菌株进行溶磷能力、固氮酶活性、分泌IAA能力测定，综合菌株培养特性、生长速度和溶磷量、固氮酶活性及分泌IAA等促生特性筛选出具有农牧业应用潜力的优良促生菌株5株，其在LB培养基上的主要培养特性和促生特性见表1。

2.2 PGPR微生物肥对豌豆生长影响

2.2.1 对豌豆株高的影响 初花期，盛花期和成熟期的豌豆植株绝对株高显著性分析显示，各施肥处理下应试植株株高和CK相比差异不显著(表2)。处理A、B、C在初花期分别高于CK 3.7%，-0.8%，6.3%；盛花期各处理均高于CK，最高为2.1%；成熟期除处理B外均高于CK，处理C达6.1%。综合株高平均增长率从大到小；处理C(4.8%)>处理A(1.6%)>处理B(-1.4%)。表明在减少20%～30%化肥量，代之以菌肥甲后对豌豆植株高度有一定程度提高。

表1 优良菌株的培养特性和促生特性

表2 微生物肥下单作豌豆各物候期的株高、根长、根系干重

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同

2.2.2 对豌豆地上生物量的影响 豌豆的3个时期干、鲜重显著性分析表明，各处理间均无显著差异(图1)。初花期处理C鲜、干重为最佳，分别为2 670.97、

1 337.31 kg/hm2，较CK分别增加15.5%、17.5%；处理B鲜、干重与CK基本持平。处理A干重略低于CK，鲜重较CK提高249.47 kg/hm2，说明处理A对提高植物鲜重有一定效果。盛花期植株鲜重处理A、C较CK分别提高8.3%、11.1%，处理B略低于CK。盛花期干物质产量虽无显著性差异，但处理C最高，较CK提高6.0%，处理A、B均较CK有所降低。豌豆成熟期处理C的鲜、干重与CK基本持平，处理A、B较CK有所减少。由此可见成熟期豌豆所需营养较高，化肥施用量不能少于70%，否则会影响地上物质产量；此外，处理C的结果说明，微生物肥甲不仅可代替20%化肥，而且不会减产。

图1 微生物肥下单作豌豆各物候期的地上植物量

2.2.3 对豌豆根长的影响 对初花期，盛花期和成熟期豌豆根长进行显著性分析显示，各生育期3个处理与CK相比均无显著性差异(表2)。处理C根长在各个生育期均为最高，处理A与处理C接近，两者均比CK有所增加，处理B在盛花期较CK降低4.4%。说明减少20%～30%化肥，代之以菌肥甲可增加豌豆的根长。

2.2.4 对豌豆根系干重的影响 对初花期，盛花期和成熟期豌豆根系干重进行显著性分析显示，各生育期3个处理与CK相比均无显著差异(表2)。减少20%～30%化肥代之以微生物肥对初花期根系干重的影响结果处理C >处理B >处理A>CK，其中，处理C较CK提高8.0%；盛花期处理C >处理A >处理B >CK，处理C可使地下根系干重提高26.4%；成熟期除处理C外，其余2个处理较CK有所下降，说明减少化肥20%、增施微生物肥甲在一定程度上可提高豌豆地下根系干重。

2.2.5 对豌豆根表面积及根系体积的影响 对初花期，盛花期和成熟期豌豆根表面积进行显著性测验分析显示，各生育期3个处理与CK相比均无显著性差异(图2 a)。初花期、盛花期和成熟期处理C与CK相比，分别提高3.4%，22.7%和8.6%；处理A在3个时期与CK相比略有减少；处理B与CK持平。同时，接种微生物肥后豌豆各生育期根系体积与CK相比也无显著性差异(图2 b)，其中，处理C最好，较CK在3个时期分别提高5.5%，42.6%和12.1%，微生物肥对豌豆根系表面积和体积的影响在盛花期要明显优于其他2个时期。

图2 微生物肥下间作豌豆各物候期的单株根系表面积和根系体积

2.2.6 对豌豆产量构成因素及籽粒产量的影响 对不同处理条件下的单株结荚数、单荚粒数、单株粒重、千粒质量进行显著性分析，各处理与CK之间均无显著性差异(表3)。处理C在产量构成因素的各个指标中均高于CK，且优于其他2个处理。处理A在单荚粒数和千粒重2个指标上高于CK，其他指标较CK略低。处理B的单株粒重低于CK，其他指标均和CK持平或略高。说明施用微生物接种剂(菌肥甲)可替代至少20%化肥并且未降低各产量构成因素。豌豆经济产量各处理与CK之间均无显著性差异，处理C的经济产量较CK提高3.2%，处理A、B略低于CK，说明减少20%化肥量，施用微生物肥甲可提高豌豆的经济产量，但减少30%化肥、施用微生物肥甲时，会对经济产量有影响。相比之下，微生物肥乙的效果不及微生物肥甲。

表3 微生物肥下单作豌豆的产量构成因素及籽粒产量

2.2.7 使用PGPR经济效益分析 对PGPR微生物肥使用后产生的经济效益进行分析(表4)，结果表明，单作豌豆减少20%化肥可节省成本276.00元，减少30%化肥量可节省成本414.00元。在减少化学肥料的同时用PGPR微生物肥代替，按1 000 mL拌种20 kg豌豆种子，每1 000 mL菌肥5.00元计算，豌豆菌肥56.25元/hm2，购买微生物肥与节省化肥的使用量相比，成本降低220.00～358.00元/hm2。

表4 PGPR微生物肥经济效益分析

3 讨论与结论

(1)筛选出Lx191、Jm92、LM4-3、LHS11和LH12-3这5个PGPR菌株，具备较强的溶磷、固氮、分泌生长激素和拮抗植物病原菌能力。将其与1株根瘤菌混合制成PGPR微生物肥，应用于豌豆，各菌株间没有明显的抑制作用。

(2)2种微生物肥代替部分正常化肥的使用后，作物的生长趋势为处理C>处理A>处理B>CK，采用微生物肥甲替代正常化肥使用量的20%时，豌豆各项指标显示良好，并有一定程度的提高，当微生物肥的使用量达到30%时产量略有下降，自制微生物接种剂(菌肥甲)的使用效果优于引进的微生物接种剂(菌肥乙)，以微生物接种剂(菌肥甲)替代20%化肥用量可使豌豆株高增加6.3%，经济产量提高3.2%。

(3)在不降低豌豆产量的前提下，使用PGPR微生物肥，可减少化肥投入量20%～30%，降低购买性资源220.00～358.00元/hm2。

(4)PGPR微生物肥使化肥减量，豌豆不减产的主要原因有土壤微生物的活动促进了土壤养分的转化，对土壤肥力的形成、植物营养的转化起着极其重要的作用；微生物肥中微生物的代谢有助于植物根系对水分、养分的吸收能力；微生物代谢活动中分泌的激素可以刺激植物生长、拮抗植物病害，对植物的生长和发育具有促进作用； 微生物在土壤中的定植和生长，可调节根际土壤的酸碱度，对于缓解西北部的碱性土壤起到重要作用[16-19]。

(5)各施用微生物菌肥处理与CK之间及各处理间差异均不显著，即各处理的生长特性及产量较对照并无大幅度改变和提高，其原因是，微生物菌肥在施用一年后对植物的效果并无明显改变，但应关注长期使用微生物肥料的增产效果和生态学效应，以降低长期使用化肥对土壤造成的退化、理化结构改变及化肥在农产品中残留及污染为目的出发，改善农产品质量、提高食品安全性，减少大量化肥使用对环境和土壤造成的污染，为农牧业可持续发展和保护生态环境提供理论依据。

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