徐 凯，徐国昌 ，张 玥，任 甫

·法医学·

改良酚/氯仿法结合miniSTR分型技术检验陈旧骨痕量DNA

徐 凯1，徐国昌2，张 玥3，任 甫4

目的建立5个miniSTR基因座的复合扩增系统，提高STR基因座对陈旧骨检材的个体识别效能。方法新设5个STR基因座的引物，分别用FAM、TAMRA、TET标记D3S3053、D18S853、D12ATA63、D6S474、D9S1122，通过PCR扩增，利用ABI3100xL遗传分析仪进行片段长度分析，对84份河南汉族无关个体血样，以及25例陈旧骨检材进行检测。结果5个基因座均得到有效扩增，在河南汉族人群中5个miniSTR基因座个体识别能力DP为0.8768～0.9623，杂合度H为0.7454～0.8934，多态信息含量PIC为0.7145～0.8214。5个miniSTR基因座总DP值为0.999 996 72。用Identifil试剂盒及miniSTR技术对25份陈旧骨检材的位点检出率分别为60.25%和84.80%。结论上述5个miniSTR基因座在河南汉族人群中等位基因分布较好，个体识别能力高，适用于个人识别和亲权鉴定，同时为陈旧骨痕量DNA样本分型提供了一种新的检测方法。

miniSTR；遗传多态性；陈旧骨

由于PCR扩增高度多态性的STR基因座是法医学领域目前用于亲子鉴定和个人识别的主流技术，在时间较久的埋尸、溺水等案件和考古人类学中，机体的软组织大部分被毁和降解，无法应用常规检材进行个体识别。因此，不断寻找新的STR基因座仍然非常重要。骨骼作为一类特殊的检材，相对于人体的其他组织抗腐败能力强且保存时间长[1]，故其在上述系列案件和研究中对于个体识别起到越来越重要的作用。陈旧骨DNA的检出率受时间、环境等因素的影响，时间越久远、环境越极端，DNA检出成功率越低，甚至失去了检材的应用价值。MiniSTR技术设计的引物更靠近核心重复序列，因此产生的STR等位基因片断长度更短，分型成功率获得很大提高[2]。MiniSTR 技术被证明是一种有效的从微量以及降解检材中获得遗传信息的方法，在提高降解检材分型成功率方面具有明显优势[3-4]。本研究根据Hill[5]等最新研究进展选择D3S3053等5个新的miniSTR位点研究其多态性，且成功应用于陈旧骨检材的个体识别，为陈旧骨等降解检材的个体识别提供了一种新的方法。

1 材料和方法

1.1 研究对象84例河南地区无关个体血样，日常受理案件中经Identifiler试剂盒分型不理想的陈旧骨(3～10 a室温保存)检材25份。

1.2 DNA提取无关血样采用Chelex法提取DNA。陈旧骨检材采用改良酚/氯仿法提取DNA。陈旧骨样本DNA提取主要步骤为：①生物冷冻研磨机研磨，液氮环境，设置预冷15 min，研磨2次，每次10 min；②pH=8.0的乙二胺四乙酸(EDTA)对骨粉脱钙，适时更换脱钙液，每次更换时均要离心，50℃水浴；③饱和酚配以三氯甲烷：异戊醇(24∶1)混液，两者体积比为4.5∶1，之后用三氯甲烷∶异戊醇混液离心；④正丁醇600 μL，混匀，离心后弃上液。乙醚600 μL，混匀，离心后弃上液，置于50℃，数分钟，挥发完全；⑤Buffer PB5 mL，RNA1 μL，冷冻离心后取上液，通过硅膜管，每次约700 μL，离心后弃下液。PB700 μL再洗1次；PE洗液700 μL，混匀，离心，重复3次，离心8 000 r/min，8 min；52℃10 min EB30 μl，加入管底中央区，52℃ 5 min，冷冻离心13 000 r/min，8 min。

1.3 PCR扩增5个miniSTR基因座的引物序列见表1，扩增体系在GeneAmp-9700中进行，DNA浓度1 ng/μL，1 GeneAmp-PCR Gold buffer，2 μM MgCl2，0.2 μM引物，1U AmpliTaq Gold DNA 聚合酶，0.16 mg/mL牛血清蛋白。总反应体积为10 μM，PCR 扩增条件为：预变性10 min 95℃，变性1 min 94℃，复性1 min 59℃，延伸1 min 72℃，复延伸45 min 60℃，最后保存在25℃。共28个循环。

表1 5个miniSTR基因座及引物序列

1.4 等位基因阶梯的制备筛选出所有等位基因片段的DNA，调整各DNA终浓度达到一致。取等体积混合，扩增混合物，其产物作为allelic ladder。把所测每个样本模板等体积混合，每个位点单独扩增，扩增条件如上所述。扩增完之后取每个位点的扩增产物1 μL加1 mL水稀释混合，在上述条件下再次扩增，经15次循环，在60℃下保存4 h。

1.5 电泳检测扩增产物1.2 μL，Hi-Di 9 μL，GS500LIZ 0.4 μL，混匀变性，于ABI PRISMI3130xL型遗传分析仪上进行检测。Gene mapper 3.2软件对电泳结果进行分析。

2 结果

2.1 5个miniSTR基因座均得到有效扩增等位基因分布频率见表2。期望杂合度(H)、多态信息含量(PIC)、个体识别能力(DP)遗传学参数见表3。

表2 河南汉族人群5个miniSTR基因座等位基因频率分布

A：等位基因；F：基因频率。

表3 河南汉族人群5个miniSTR基因座的H、PIC、DP值

Loci：STR基因位点；H：亲合度；PIC：多态信息含量；DP：个体识别能力。

2.2 陈旧骨检材的检测情况25例陈旧骨检材用Identifiler(16位点)试剂盒检测时，有1例几乎没有获得目的片段，检出率50%(含)以下的有9例，总位点检出率为241/400=60.25%。经5个miniSTR基因座检测，有15例扩增完全显示，其中1例无扩增产物，总位点检出率为106/125=84.80%。25例检材的检测情况及统计结果见表4。

表4 Identifiler试剂盒(A)和5个miniSTR基因座(B)检测结果比较 例(%)

3 讨论

STR是一类广泛存在于真核生物基因组中的DNA重复序列。STR以核心重复单位数目的变化构成遗传多态性，已广泛应用于遗传病的诊断和法医学的鉴定。针对CODIS系统所设计的miniSTR 基因座已有报道，但并非所有CODIS 基因座均适合重新设计miniSTR 引物，且有些基因座在中国人群的多态性较低，仅用现有试剂盒检验难以满足特殊案件个体识别及亲权鉴定的需要[6]。马威[7]等人用D10S1248、D14S1434 和D22S1045 3个miniSTR 基因座对东北汉族群体的141 名随机个体样本进行遗传多态性研究，认为3 个基因座在东北汉族均具有高度的遗传多态性，在群体遗传学和法医学研究中有一定的应用价值。

在本研究选择的5个位点经Hard-Weinberg平衡检验，均为P>0.05，说明5个位点都符合Hard-Weinberg平衡。5个基因座的联合DP值为0.999 996 72，均属于多态性较好的遗传标记。个人识别能力为0.8768～0.9623，提示为能够适合法医应用的遗传标记。与目前广泛使用的常规商品化试剂盒相比，5个miniSTR能达到相同的个体识别力。在法医DNA检验中，STR技术虽已广泛用于个人识别和亲权鉴定方面，但是对于法医学中一些微量以及降解的检材，STR技术并不能成功地得出结论，经常会出现“优势扩增”或者“无效扩增”。miniSTR技术在设计引物时，使其结合在更靠近核心重复序列的侧翼序列，PCR扩增的产物就会比STR基因座更短一些[8-9]。MiniSTR的引物位置决定PCR产物的大小，但与原来STR基因座相比，核心序列的重复次数却没有改变。STR基因座扩增成功率与等位基因长度成反比，当样本DNA降解到100 bp左右时，用常规试剂盒检测扩增效果常常不尽理想。

不同情况的陈旧骨骼存留的STR 基因座检出结果会有所不同，个体识别能力也不同。分析原因，主要是由于STR 基因座片断长度的差别，使不同的基因座抗降解的能力有所差异，从而使不同基因座在同一检测条件下检出率呈现差异。本研究选用扩增片段很短的miniSTR基因座(70～140) bp对Identifiler试剂盒扩增不成功的25例陈旧骨检材再次进行miniSTR基因分型，结果大部分得到了清晰的等位基因条带，显示miniSTR技术检测小片段DNA的成功率比一般商品化试剂盒高，有助于法医学上降解检材的检测。

总之，陈旧骨的个体识别目前尚缺乏统一的标准，陈旧骨基因水平的检测需要更准确、简单、快速的检测指标。MiniSTR作为STR检验的一个新的发展方向，是商品化STR试剂盒的重要补充，可以更好地解决法医学实践中遇到的降解检材痕量DNA分型的难题，能更好地为法庭科学服务。

[1]张付瑶,王传海,杜舟,等.DNA Typer TM15与Identifiler TM试剂盒对陈旧骨骼、牙齿和指甲样本检验结果的比较分析[J].中国实验诊断学,2012,16(9):1580-1582.

[2]徐国昌,任甫,刘海东.辽宁汉族人群5个miniSTR基因座遗传多态性[J].中国法医学杂志,2012,27(3):157-158.

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AnalysisonTraceDNAfromObsoleteBonesbyPhenol-chloroformCoupledwithMiniSTRTechnicalMethod

XU Kai，XU Guo-chang,ZHANG Yue,et al

(Henan Province People’s Procuratorate,Zhengzhou 453000,China)

ObjectiveTo establish five loci multiplex amplification miniSTR systems,and to improve forensic detection performance of the obsolete bone samples with the STR loci.MethodsThe new five STR loci(D3S3053,D18S853,D12ATA63,D6S474,D9S1122) primers were designed and marked by FAM,TAMRA,TET,amplified by PCR and analysized using the ABI3100xL genetic analyzer for fragment length analysis.84 Henan Han Nationality blood samples of unrelated individuals,and 25 cases of obsolete bone samples were collected for testing.Results5 loci were effectively amplified,the 5 miniSTR recognition rate(DP) of individual loci in the Han Nationality population was 0.8768～0.9623,the heterozygosity (H) was 0.7454～0.8934,and the polymorphism information content (PIC) is 0.7145～0.8214.The total 5 miniSTR loci DP was 0.999 996 72.The detection rate of remaining genetic locus of the 25 obsolete bones was 84.80% by Identifiler kit,and 60.25% by miniSTR method.ConclusionThe five miniSTR loci in Han Nationality population in Henan Province is better distributed and easily recognized as a individual identification and paternity testing,and provides a new detection method for DNA samples typing of obsolete bones.

miniSTR; genetic polymorphisms; obsolete bones

河南省科技厅基础与前沿技术研究项目(132300410088) 辽宁省百千万人才工程培养经费资助项目(2010921042)

2013-11-20

1.河南省人民检察院，河南郑州 453000 2.南阳理工学院生物人类学研究所，河南南阳 473004 3.重庆市公安局，重庆 400000 4.辽宁医学院人类学研究所，辽宁锦州 121000

徐凯(1974-)，男，河南驻马店人，法医师，从事法医病理学研究。

徐国昌，硕士，副教授，E-mail:xuguoch@163.com

Q987

A

1672-688X(2014)01-0057-04